PTEN和p27及cyclin D1蛋白在大肠癌组织中的表达及相关性研究

    作者：陈成　李乐平　靖昌庆　史秀珊    作者单位：山东大学附属省立医院 普通外科　

    【摘要】  目的：研究大肠癌组织中PTEN、p27和cyclin D1蛋白的表达及三者间的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测58例大肠癌组织、58例癌旁组织和14例正常大肠黏膜中PTEN、 p27和cyclin D1蛋白的表达情况。结果：大肠癌组织中PTEN和 p27蛋白的阳性表达率分别为65.52%（38/58）和53.45%（31/58），较癌旁组织和正常组织明显降低（P＜0.05）；cyclin D1蛋白的阳性表达率为60.34%（35/58），较癌旁组织及正常组织显著升高（P＜0.05）。三者在大肠癌组织中的表达存在相关性，且均与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移和Dukes分期有关（P＜0.05）。结论：PTEN、 p27和cyclin D1基因的异常改变参与大肠黏膜细胞的恶性转化过程，且三者之间存在相关性。联合检测三者表达水平可作为评价大肠癌病理生物学行为的客观指标之一。

    【关键词】  大肠肿瘤·PTEN·P27·Cyclin D1

     Research on expression of PTEN and p27 and cyclin D1 protein in colorectal carcinoma

    CHEN Cheng , LI Le-ping, JING Chang-qing, SHI Xiu-shan

    Department of General Surgery ,  Provincial Hospital Affiliated to Shandong University

    (Jinan 250012 , China )

    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the correlation between PTEN, P27 and cyclin D1 expression in colorectal carcinoma. Methods: Immunohistochemistry was applied to examine the expression of PTEN, P27 and cyclin D1 in 58 cases of human colorectal carcinoma, 58 cases of tumor sideward mucosa and 14 cases of normal colorectal mucosa. Results: Positive expressive rates of PTEN and P27 protein in colorectal carcinoma were 65.52%（38/58） and 53.45%（31/58）, which were lower than those in tumor sideward mucosa and normal colorectal mucosa. Positive expressive rate of cyclin D1 in colorectal carcinoma was 60.34%（35/58）, which was higher than that in tumor sideward mucosa and normal colorectal mucosa.The expression of PTEN,P27 and cyclin D1 in colorectal carcinoma correlated with each other, and which were associated with degree of differentiation of carcinoma, Dukes stage and lymph node metastasis of the tumors. Conclusion: The abnormal expression of PTEN,P27 and cyclin D1 participate the malignant conversion process of the colorectal mucosa cell and the expression levels of the PTEN,P27 and cyclin D1 protein may be used to evaluate the pathologic biology behavior of colorectal carcinoma.

    【KEY WORDS】 Colorectal neoplasms·PTEN·P27·Cyclin D1 　

    　大肠癌的发生、发展是多因素、多阶段的复杂过程，是由多种基因参与、彼此协同和累积的分子事件。其中细胞周期失控与肿瘤发生、发展密切相关。PTEN、p27和cyclin D1均参与细胞周期的调控。本研究采用免疫组织化学技术检测了PTEN、p27和cyclin D1蛋白在大肠癌组织、大肠癌旁组织、正常大肠组织中的表达水平，及其与临床病理参数的关系，以探讨PTEN、p27和cyclin D1蛋白表达在大肠癌发生、发展中的作用及相互关系。

    1　资料与方法

    1.1　一般资料　收集2006年10月—2007年9月在我院行大肠癌根治术的58例患者的大肠癌组织，其中男35例，女23例。年龄31～79岁，平均年龄57.9岁。高中分化腺癌38例，低分化腺癌20例。临床Dukes分期A期14例，B期25例，C期15例，D期4例。患者术前均未接受化学、放射和免疫治疗等。同时取该58例患者的癌旁组织（距肿瘤中心≥15 cm）及14例正常大肠黏膜（外伤致大肠破裂择期还纳术患者）作为对照。

    1.2　试剂　小鼠抗人PTEN、小鼠抗人p27和兔抗人cyclin D1单克隆抗体工作液，SP试剂盒，DAB显色试剂盒(均由福州迈新公司提供)。

    1.3　标本处理　上述标本石蜡包埋后4 μm切片，贴附于经2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APES）丙酮预处理过的载玻片上，烤片后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化组织切片，3%过氧化氢孵育10 min。切片放入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，微波炉抗原修复。

    1.4　结果判断　PTEN蛋白阳性表达在细胞质；p27蛋白阳性表达主要在细胞核，也有部分在细胞质；cyclin D1蛋白阳性表达在细胞核，均为棕黄色颗粒。每张切片随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算PTEN、 p27和cyclin D1蛋白阳性细胞所占比例，＜10%为表达阴性(-)，10%～25%为低表达(+)，25%～50%（不含25%）为中表达（++），＞50%为高表达(+++)。

    1.5　统计学处理　应用SPSS13.0统计软件对数据进行Fisher精确概率法四格表、列联表χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　PTEN、p27和cyclin D1蛋白的表达与大肠癌临床病理因素的关系　PTEN、p27蛋白在高中分化大肠癌组织中的阳性表达率明显高于低分化大肠癌；而cyclin D1蛋白则相反（P＜0.05）。58例患者中有淋巴结转移的19例，无淋巴结转移者39例，PTEN、p27蛋白阳性表达率在有淋巴结转移时较低，而cyclin D1则相反（P＜0.05）。根据Dukes分期，A+B期PTEN、p27蛋白阳性表达率明显高于C+D期（P＜0.05）；而cyclin D1蛋白阳性表达率A+B期明显低于C+D期（P＜0.05）。另外PTEN、p27和cyclin D1蛋白表达与患者的性别、年龄、部位、大小及浸润深度无明显相关（P＞0.05，表1）。

    2.2　大肠癌组织中PTEN、p27和cyclin D1蛋白表达间的关系　PTEN、p27和cyclin D1蛋白在正常大肠黏膜与癌旁组织中阳性表达率分别为100%（14/14）与93.10%（54/58）、100%（14/14）与96.55%（56/58）及0（0/14）与1.72%（1/58），两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。大肠癌组织中PTEN、p27和cyclin D1蛋白阳性表达率为65.52%（38/58）、53.45%（31/58）和60.34%（35/58），与对照组差异均有统计学意义（P＜0.05，图1）。PTEN、p27蛋白在大肠癌组织中表达呈正相关；PTEN、cyclin D1蛋白表达在大肠癌组织中表达呈负相关；p27、cyclin D1蛋白在大肠癌组织中表达呈负相关（表2）。

    3　讨论

    3.1　大肠癌组织中PTEN蛋白表达及意义　PTEN是迄今为止发现的第1个具有双特异性磷酸激酶活性的抑癌基因。近年研究发现，在子宫内膜癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌及胃癌等多种肿瘤中存在PTEN基因的缺失或（和）突变。但是其与大肠癌的关系研究较少，且结论不甚一致。Khaleghpour等［1］用RT-PCR检测结肠癌细胞中PTEN，发现其明显缺失。郑国宝等［2］研究发现PTEN的表达与大肠癌Dukes分期和淋巴结转移有关，而杨福文等［3］认为PTEN蛋白的表达与肿瘤的淋巴结转移、临床分期和生存率无明显关系。本研究发现PTEN蛋白在大肠癌组织中阳性表达（65.52%）明显低于癌旁组织和正常大肠黏膜组织（100%），且与大肠癌组织的分化程度、Dukes分期和有无淋巴结转移呈明显相关性，分化程度越低、分期越晚和有淋巴结转移时PTEN蛋白表达明显降低，提示PTEN在大肠癌组织的发生和发展中起着重要作用。Komazawa等［4］研究发现PTEN能使PIP2向PIP3的转化发生逆转，抑制了PI3激酶的磷酸化作用，从而阻断Akt及下游激酶的活性。通过改变PIP3途径，抑制诱导Akt依赖性细胞分裂增殖，并促进凋亡而达到抑制肿瘤的作用。因此，PTEN 蛋白表达水平下调或缺失在一定程度上促进了细胞的恶性转化和肿瘤的形成。

    3.2　大肠癌组织中p27蛋白表达及意义　p27是周期依赖性蛋白激酶抑制剂家族（cyciin dependent kinase inhibitors, CDKIs）的成员之一，其表达产物p27蛋白在人体多种恶性肿瘤细胞增殖和分化的调控中起着非常重要的作用，它的过度表达可使细胞周期停止在G1中期［5］。Palmqvist等［6］采用免疫组织化学方法研究了89例结直肠癌组织中的p27表达，发现p27蛋白低水平表达很普遍。本研究发现p27蛋白在大肠癌组织中明显低表达，仅为53.45%，且在低分化和有淋巴结转移、Dukes分期较晚的肿瘤细胞中表达缺失更加明显，提示p27蛋白指标可作为评价大肠癌生物学行为和患者预后的重要指标。Loda等［7］用多因素分析发现p27是个独立预后因素。

    3.3　大肠癌组织中cyclin D1蛋白表达及意义　cyclin D1是G1周期素家族最重要的成员，为目前公认的癌基因，cyclin D1过表达能缩短G1期,促使细胞提前进入S期，引起细胞生长失控、转化和癌变。在正常人体组织中，cyclin D1蛋白呈低水平表达，表达失控时，将引起细胞增殖周期失调，导致恶性肿瘤发生。李景和等［8］在研究中发现cyclin D1在大肠癌组织中的过表达率(87.1%)明显高于正常黏膜组织(60%)，提示cyclin D1的过表达率可能与大肠癌的发生有关。本研究发现正常大肠组织和癌旁组织中cyclin D1蛋白表达率分别为0和1.72%，明显低于大肠癌组织的60.34%，与报道相符，推测cyclin D1与大肠癌的发生关系密切。cyclin D1不但与肿瘤的发生相关，还与肿瘤的发展、转移和预后密切相关。本研究表明cyclin D1蛋白在低分化和有淋巴结转移、分期晚的肿瘤中表达明显增高。

    3.4　PTEN、p27和cyclin D1蛋白在大肠癌组织中表达的相关性　p27作为PTEN的下游靶分子起着PTEN和底物间的桥梁作用。An等［9］报道在子宫内膜癌病例中PTEN和p27蛋白表达存在相关性；Bruni等［10］研究甲状腺癌发现PTEN的表达在癌组织中下降，p27与之平行，二者之间存在着密切的关联。本研究发现大肠癌组织中PTEN和p27蛋白表达呈正相关（P＜0.05），提示PTEN可能通过上调p27的表达来抑制细胞周期，达到抑制肿瘤发展的作用，但是具体机制不详。Fredersdorf等［11］在乳腺癌的研究中发现，p27蛋白表达与cyclin D1蛋白表达呈正相关。但刘群清等［12］在研究胃黏膜癌变过程中两种蛋白表达时发现它们呈负相关性。本研究结果与之相同。p27和cyclin D1在肿瘤发生和发展中的相互关系还有待进一步研究证实。

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[3] 杨福文，胡俊波，杨传永.大肠良恶性肿瘤中PTEN的蛋白表达及其临床意义[J].临床外科杂志，2004，12（7）：415-417.

[4] Komazawa N, Suzuki A, Sano S, et al. Tumorigenesis facilitated by Pten deficiency in t he skin:Evidence of p53-Pten complexformation on t he initiation phase[J]. Cancer Sci, 2004,95（8）:639-643.

[5] Toyoshima H, Hunter T. P27 a novel inhibitor of G1 cyclin-CDK protein kinase is relate to p27[J]. Cell, 1994,78（1）:67-74.

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[8] 李景和，文继舫，冯德云，等.P2MAPK、cyclin D1和p53蛋白在大肠癌中的表达及其相关性[J].临床与实验病理学杂志,2000,16（5）:391-392.

[9] An HJ, Shim J Y, Kim SJ. Alteration of PTEN expression in endomet rial carcinoma is associated wit h down-regulation of cyclin-dependent kinase inhibitor,p27[J]. Histopathology, 2002,41（5）:437-445.

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[11] Fredersdorf S,Burns J, Milne AM, et al. High level expression of p27（kip1） and cyclin D1 in some human breast cancer cells: inverse correlation between the expression of p27（kip1） and degree of malignancy in human breast and colorectal cancers [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94（12）:6380.

[12] 刘群清，张桂英.Cyclin D1和p27在胃黏膜癌变过程中的表达[J].中华肿瘤防治杂志:2007,11（22）:1700-1702.