肝细胞癌Tenascin蛋白和微血管密度检测及临床意义
发表时间：2009-08-12 浏览次数：786次
作者：张建平 胡三元 倪家连 景洪标 曹永成 作者单位：济南军区总医院 1肝胆外科 3病理科 (山东 济南 250031) 2山东大学齐鲁医院 普外科 (山东 济南 250012)
【摘要】 目的：研究细胞外基质Tenascin(TN)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达，探讨TN对HCC肿瘤微血管生成、浸润、转移及预后的影响。方法：采用免疫组织化学方法检测63例HCC癌组织、癌旁组织及15例肝炎后肝硬化组织、10例正常肝组织中TN表达，同时检测HCC组织微血管密度(CD105-MVD)，分析TN表达与HCC病理学特点及肿瘤微血管生成的关系。结果：HCC组织TN阳性率65.1%，癌旁组织69.8%，肝硬化组织20.0%，正常肝组织无阳性表达;HCC组织及癌旁组织TN表达阳性率及表达强度评分显著高于肝硬化组织及正常肝组织(χ2=27.67，P<0.01;F=12.82，P<0.01);HCC组织TN表达阳性率与癌旁组织比较差异无统计学意义(χ2=0.325，P>0.05);TN表达与HCC的组织学分级，病灶数量，有否包膜浸润、肿瘤转移及肿瘤微血管生成密切相关。结论：HCC组织TN的表达上调促进了肿瘤的新生血管形成，导致术后肿瘤的早期复发和转移;HCC组织TN检测可有效反映其恶性程度、浸润、转移及预后。
【关键词】 癌，肝细胞·Tenascin·微血管密度
Detections of tenascin and microvascular density in hepatocellular carcinoma and their clinical significance
ZHANG Jian-ping1, HU San-yuan2, NI Jia-lian1, JING Hong-biao3, CAO Yong-cheng3
1Department of Hepatobiliary Surgery, 3Department of Patholegy, General Hospital of Jinan Military Area (Jinan 250031, China)
2Department of General Surgery, Qilu Hospital of Shandong University (Jinan 250012, China)
【ABSTRACT】 Objective: To study the expression of tenascin in hepatocellular carcinoma(HCC)and to investigate the roles of tenascin expression in microvessel angiogenesis, invasion, metastasis and prognosis of HCC. Methods: Formalin fixed, paraffin wax embedded specimens from 63 HCC patients were stained with an anti-tenascin monoclonal antibody, and the measurements were also done for paracancerous specimens from the same patients and specimens from 15 patients with liver cirrhosis and 10 normal liver. The correlation was analyzed between expression of tenascin and clinicopathological features as well as microvessel angiogenesis. Results: Tenascin immunoreactivity was observed in 65.1% samples of HCC, 69.8% of paracarcinoma, 20.0% of liver cirrhosis and negative of normal liver samples. Positivity and intensity of tenascin expressions in samples of HCC and paracarcinoma were higher than those in samples of cirrhotic and normal liver. Tenascin expression was correlated with Edmondson-Steiner grades, tumour numbers, capsule invasion, tumour metastasis and microvessel angiogenesis. Conclusion: The up-regulation of tenascin expression may play an important role in invasion and metastasis of HCC.
【KEY WORDS】 Carcinoma, hepatocellular·Tenascin·Microvascular density
原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，具有恶性度高、侵袭性强、切除后易复发和转移及预后差等特点，即使是小肝癌其5年肿瘤复发率高达50%。本研究采用免疫组织化学方法测定肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织细胞外基质Tenascin(TN)及肿瘤微血管密度(microvascular density，MVD)表达，探讨肝癌细胞外基质改变与临床病理因素的关系及对预后的影响。
1 资料与方法
1.1 标本来源与分组 收集济南军区总医院2000年1月—2004年12月经手术切除、病理组织学确诊的HCC标本63例，其中男56例，女7例;年龄24～72 岁，平均年龄(53.3±11.2)岁。病理分级(Edmondson-Steiner分级)：Ⅰ～Ⅱ级25 例，Ⅲ～Ⅳ级38例;TNM分期(UICC/AJCC第6版，2002年)：Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ期22例;肿瘤直径1.8～12.0 cm，平均6.12 cm;肿瘤包膜完整者28例，有包膜侵犯者35例;有转移者(包括淋巴结转移、肝外转移、胆管或门静脉癌栓)22例，无转移41例。所有病例术前均未接受放疗和化疗。切取癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘1～2 cm)，另取15例肝炎后肝硬化组织(为门静脉高压症行贲门周围血管离断术中切取的活组织)及10例外伤性肝破裂和肝血管瘤的正常肝组织分别作为病理及正常对照。
1.2 主要试剂及方法 小鼠抗人TN单克隆抗体购自武汉博士德生物有限公司，小鼠抗人CD105单克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒均购自北京中山生物有限公司，工作浓度1∶50稀释。所有组织标本行10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm 厚连续切片及HE 和SP免疫组织化学染色。免疫组织化学操作步骤按试剂盒说明书进行，用PBS替代一抗作阴性对照，以试剂盒所附阳性切片作阳性对照。
1.3 结果判定标准 TN在细胞外基质中的阳性表达为基质呈断线状、连续线状或网状棕黄色着色，细胞中的阳性表达为胞质呈棕黄色着色。免疫组织化学评分：细胞外基质TN无表达计为0分，细胞外基质TN局部断线状表达为1分，连续线状表达为2分，网片状表达为3分。据阳性细胞率对细胞阳性表达评分，具体方法为：每张切片随机观察5个不同的高倍视野，无阳性细胞记为0分，阳性细胞率1%～25%为 1分，26%～50% 为2分，51% 以上3分。细胞外基质TN阳性表达计分与细胞阳性表达计分之和为该病例评分值。评分值≤2分为TN低表达，>2分为高表达。CD105-MVD判断参考Weidner等[1]报道的微血管计量方法，即每一个染成棕黄色，可与周围血管、肿瘤细胞及其他结缔组织区分开的内皮细胞或内皮细胞簇，不论管腔和红细胞出现与否，均作为一个单一的、可计数的血管。先于200倍光学显微镜下确定5个微血管着色最密集的区域，然后于400倍视野内计数微血管，取5个视野的均值，四舍五入后作为MVD值(微血管个数/0.37 mm2)。TN评分与CD105-MVD计数由2名病理科医师采用双盲原则评定。
1.4 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件包进行分析，阳性率比较采用χ2检验或四格表精确概率法，组间表达强度评分比较采用F检验，术后1年复发率及中位生存时间比较采用Log-rank检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TN在不同肝脏组织中的表达 免疫组织化学染色发现，肝癌组织及癌旁组织TN蛋白阳性染色主要定位于癌巢及癌旁的肝细胞质内及其周围的细胞外基质，呈棕黄色颗粒。63例HCC组织中有41例表达TN蛋白，阳性率65.1%，对应癌旁组织TN阳性率69.8%;肝硬化组织TN阳性率为20.0%;而正常肝组织无阳性表达。4组间TN阳性表达率差异有统计学意义(χ2=27.67，P<0.01，表1)。癌旁组织TN表达率高于HCC组织，但差异无统计学意义(χ2=0.325，P>0.05，见表1)。HCC组织、癌旁组织TN表达强度评分与肝硬化组织及正常组织相比，差异均有显著性(F=12.82，P<0.01，见表1)。
2.2 TN在HCC组织中的表达及与临床病理因素的关系 研究表明，TN蛋白在HCC组织中的阳性表达与患者的性别、HBsAg状态、甲胎蛋白水平、肿瘤大小、肝功能评级及是否合并肝硬化无关(P>0.05)，与其组织学分级、病灶个数、有无包膜浸润和是否转移等有关(P<0.05)。组织学分级差、有肝内外转移及肿瘤包膜浸润的阳性表达率均高(P<0.05，表2)。
2.3 TN表达与HCC新生血管的相关性 41例TN阳性表达的HCC组织MVD值为(66.46±18.46)/高倍视野，22例阴性表达者MVD值为(37.68±19.94)/高倍视野，二者差异有统计学意义(t=5.738，P<0.01)。
2.4 HCC组织TN表达与患者术后复发及生存时间的关系 生存分析显示，63例HCC患者中，29例为TN低表达，术后1年复发率为10.34%(3/29);34例为TN高表达，术后1年复发率为26.47%(9/34)，2组比较差异有统计学意义(P<0.01);TN低表达组中位生存时间为22个月，高表达组中位生存时间为38个月，差异有统计学意义(P<0.01)。
3 讨论
HCC术后复发、转移已成为目前进一步改善患者生活质量和提高生存率的瓶颈。细胞外基质是组成间质和上皮血管中基质的不溶性结构成份，包括各型胶原、蛋白多糖、糖蛋白和弹性蛋白等。细胞外基质结构或(和)成分改变可能导致细胞外微环境变化，对细胞转化、肿瘤生成及复发、转移有重要影响。
TN是细胞外基质中一种具有独特的六臂体结构的寡聚糖蛋白，具有影响细胞信号传递、抑制细胞黏附、促进细胞增殖及形态形成等多种作用[2-3]。研究显示，TN短暂表达于胚胎发育期，成年组织无表达或特定组织弱表达，而于许多恶性肿瘤中高表达[4-5]。有关TN在HCC、癌旁组织表达规律及其与HCC临床病理因素的研究罕见报道。本研究采用半定量免疫组织化学评分方法研究正常肝脏组织、肝硬化组织、HCC及癌旁组织中的TN表达。结果显示，HCC及癌旁组织TN蛋白阳性表达率显著高于肝硬化及正常肝组织;TN多表达于HCC及癌旁组织细胞外基质、基底膜及癌巢周围基质，胞质亦有表达;TN表达与HCC的组织学分级、病灶个数、有无包膜及是否合并转移等因素有关。本研究提示，HCC及其癌旁组织细胞外基质成分及性质发生了改变;HCC细胞形成了一种新的细胞外基质黏附于细胞间;TN表达上调与HCC的恶性程度高、有浸润及转移等有关，可能预示着细胞恶性转化及局部肿瘤的演进。
文献报道，细胞外基质TN表达可能与肿瘤的血管生成及预后有关[6-7]，肿瘤细胞质TN阳性表达提示患者预后不良[8]，肿瘤浸润包膜TN阳性表达是局部复发的标志[9]。本研究显示，TN阳性表达患者HCC组织中MVD显著高于阴性表达者;TN低表达组1年复发率显著低于高表达者，而中位生存时间显著长于TN高表达组。综上所述，HCC组织TN的高表达促进了肿瘤的新生血管形成，导致术后肿瘤的早期复发和转移，降低了远期生存时间;肝癌的TN检测有助于对HCC患者术后预后的预测，对TN高表达患者采取有针对性地后续综合治疗;针对TN的研究将为筛选治疗HCC药物的提供新靶点。
【参考文献】 [1] Weidner N, Follcman J, Pazza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma[J]. Natl Cancer Inst, 1992,84(6):1875-1887.
[2] Midwood KS, Schwarzbauer JE. Tenascin-C modulates matrix contraction via focal adhesion kinase- and Rho-mediated signaling pathways[J]. Mol Biol Cell, 2002,13(10):3601-3613.
[3] Jones PL, Cowan KN, Rabinovitch M. Tenascin-C, proliferation and subendothelial fibronectin in progressive pulmonary vascular disease[J]. Am J Pathol, 1997,150(4):1349-1360.
[4] Erickson HP, Bourdon MA. Tenascin: an extracellular matrix protein prominent in specialized embryonic tissues and tumors[J]. Annu Rev Cell Biol, 1989,5(11):71-92.
[5] Koukoulis GK, Gould VE, Bhattacharyya A, et al. Tenascin in normal,reactive,hyperplastic,and neoplastic tissues:biologic and pathologic implications[J]. Hum Pathol, 1991,22(7):636-643.
[6] Zagzag D, Friedlander DR, Dosik J, et al. Tenascin-C expression by angiogenic vessels in human astrocytomas and by human brain endothelial cells in vitro[J]. Cancer Res, 1996,56(1):182-189.
[7] Ishihara A, Yoshida T, Tamaki H, et al. Tenascin expression in cancer cells and stroma of human breast cancer and its prognostic significance[J]. Clin Cancer Res, 1995,1(9):1035-1041.
[8] Yoshida T, Ishihara A, Hirokawa Y, et al: Tenascin in breast cancer development-is epithelial tenascin a marker for poor prognosis[J]. Cancer Lett, 1995,90(1)：65-73.
[9] Jahkola T, Toivonen T, Virtanen I, et al. Tenascin-C expression in invasion border of early breast cancer: a predictor of local and distant reccurence[J]. Br J Cancer, 1998,78(11):1507-1513.
