胃癌腹膜微转移的临床研究

　　作者：陈月光　何庆泗　孙国瑞　王琰珉　张朝阳　Gyanendra Swar    作者单位：山东大学齐鲁医院　普外科　(山东　济南　250012)

　　【摘要】  目的：研究胃癌患者腹膜微转移的相关因素及临床意义，为临床手术切除范围探寻理论依据。方法：应用CK19和CK20免疫组织化学方法， 检测62例胃癌患者横结肠系膜前叶、胰腺被膜、网膜囊后壁和盆底腹膜组织，并与HE染色及腹腔灌洗液细胞学检查对比。结果：62例胃癌患者的腹膜组织常规病理HE染色均未见癌细胞，免疫组织化学证实腹膜微转移阳性率为43.55%(27/62)，远高于腹腔灌洗液癌细胞的14.52%(9/62)。胃癌腹膜微转移与肿瘤的大小、浸润深度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05) ，而与肿瘤的部位、患者年龄、性别无关(P>0.05)。结论：用免疫组化方法检测胃癌腹膜微转移，可为胃癌根治术术式的选择和术后综合治疗提供可靠依据。对于进展期胃癌患者，应常规腹膜取材检测微转移，多点取材有助于提高微转移检出率。

　　【关键词】  胃肿瘤·腹膜·转移·细胞角蛋白·网膜囊

　　Research of peritoneal micrometastasis in patients with gastric carcinoma

　　CHEN Yue-guang, HE Qing-si, SUN Guo-rui, WANG Yan-min, ZHANG Zhao-yang， Gyanendra Swar

　　Department of General Surgery, Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012，China)

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate the related factors and clinical significance of peritoneal micrometastasis in patients with gastric carcinoma, providing theoretical basis for resection range。Methods: CK19，CK20 immunohistochemistry were performed on 62 patients' tissues taken from anterior lobe of transverse mesocolon, posterior wall of omental bursa, pancreatic capsule and rectovesical pouch or Douglas pouch during the operations, compared with HE staining and peritoneal lavage cytology(PLC). Results：No metastasis was found by HE staining. Peritoneal micrometastasis were found in 27 cases out of 62 by immunohistochemistry, and its positive rate was 43.55%，obviously higher than PLC (14.52%).The peritoneal micrometastasis of gastric carcinoma had relations with diameter of tumor ，depth of infiltration，clinical stage，lymph node metastasis(P<0.01), but no relation with the location of gastric carcinoma ，age or sex of the patients(P>0.05). Conclusion: Immunohistochemistric measure of CK 19 and CK20 can be effective to detect the micrometastasis of gastric carcinoma,which is helpful to guide clinical staging and useful to provide evidence for accurate selection of operation and postoperative treatment.Routine detection of peritoneal micrometastasis should be taken in patients of advanced gastric carcinoma，especially with a large size of serosa invasion.Multiple spots sampling is helpful to improve the detection rate. Anterior lobe of transverse mesocolon and pancreatic capsule should be peeled，and radical resection of omental bursa should be considered as routine operation in these patients.

　　【KEY WORDS】 Stomach neoplasms·peritoneum·Micrometastases·Cytokeratin·Omental bursa

　　胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，多数患者经标准胃癌根治术后仍死于远处复发，原因之一是肿瘤发生了腹腔转移。腹腔转移多由腹膜微转移发展而来。微转移是指非造血系统肿瘤在机体各种组织、体液及细胞移植物中检测到的镜下及亚显微水平的肿瘤残留，是常规临床病理学方法不能检出的、隐匿在原发灶以外组织的转移[1]。术中腹膜取材研究胃癌微转移多为单一部位取材。本研究首次实施术中多个不同部位的腹膜取材，采用细胞角蛋白(cytokeratin，CK)中的CK19和CK20这2个得到广泛认同的上皮性肿瘤标志物作为检测指标对胃癌微转移进行研究，比较不同取材部位之间的差异和联系，以及CK19、CK20对于胃癌腹膜微转移的检测价值，探讨胃癌腹膜微转移的发生和规律，为指导临床分期、判断预后、制定手术及术后治疗方案提供理论依据。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　选取2007年10月—2008年6月山东大学齐鲁医院普外科行手术治疗的胃癌患者62例，其中男39例，女23例;年龄38～76岁，平均年龄55.4岁。所有患者术前及术中均未发现远处转移、肝转移、腹腔转移。其中行根治性远端胃大部切除术37例，根治性近端胃大部切除术15例，全胃切除术10例。根据UICC 1987年TNM分期标准，Ⅰ期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期37例。1例死于术后出血，其余均恢复良好出院。另取胃溃疡患者5例，取其相同部位腹膜，作为对照。

　　1.2　术中取材　术中如发现有腹水则吸取之;无腹水者以生理盐水分别冲洗腹腔及网膜囊，吸出收集，术后行腹腔灌洗液细胞学检查(peritoneal lavage cytology，PLC)。切除肿瘤之前分别自横结肠系膜前叶、胰腺被膜、网膜囊后壁近胰腺上缘处、直肠膀胱陷凹(女性为直肠子宫陷凹)处各取活组织2块，约黄豆粒大小，术后行HE染色及CK19、CK20免疫组织化学检测。常规清除第1、2站淋巴结并分组，与胃癌切除标本一起送检。另取胃溃疡患者的相同部位的腹膜组织行免疫组织化学染色。

　　1.3　免疫组织化学检测及判定标准　所有腹膜组织块以10%甲醛固定，石蜡包埋。每只蜡块连续切片5张，厚度为4 μm，其中1张用于HE染色，2张用于CK19染色，2张用于CK20染色。CK19、CK20单克隆抗体和PV9000试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉公司。

　　CK表达于上皮细胞质，呈现棕黄色(图1)。以胃溃疡患者腹膜组织切片为阴性对照;以病理证实为腹膜转移瘤的胃癌患者的转移瘤免疫组织化学染色做阳性对照。若HE染色阴性而CK19或CK20阳性，即视为发生了微转移。

　　1.4　统计学处理　应用SPSS13.0软件进行统计学分析。CK19、CK20与PLC的差异，4种系膜之间关联性分析及腹膜微转移与肿瘤浸润深度、淋巴结转移的各临床病理因素的关系均用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　免疫组织化学法检测结果　胃溃疡患者共5例，其腹膜免疫组织化学染色均为阴性。62例胃癌根治术患者的横结肠系膜前叶、网膜囊后壁、胰腺被膜、盆底腹膜组织，常规病理检测均为阴性。免疫组织化学法检测62例患者横结肠系膜阳性22例(35.48%)，胰腺被膜阳性22例(35.48%)，网膜囊后壁阳性19例(30.65%)，盆底腹膜阳性16例(25.81%)。腹膜微转移阳性患者共27例(43.55%)，其中CK19表达阳性者21例，CK20表达阳性者24例，CK19及CK20均为阳性表达者18例，二者均阴性者35例。

　　2.2　免疫组织化学法与腹腔冲洗液细胞学检查结果的比较　腹腔冲洗液细胞学检查阳性者9例，阳性率为14.52%，远低于应用CK单抗检测腹膜组织的阳性率，二者之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3　CK19和CK20的比较　27例腹膜微转移阳性患者中，CK19和CK20分别检出19例(30.65%)和23例(37.10%)，二者对腹膜微转移检测的灵敏性差异无统计学意义。

　　2.4　胃癌腹膜微转移与临床病理因素的关系　胃癌患者腹膜微转移与肿瘤的大小、浸润深度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤部位及分化类型无关(P>0.05，表1)。4个取材部位腹膜阳性率与肿瘤的大小、浸润深度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、部位与分化类型无关(P>0.05);不同取材部位之间阳性率的比较差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3　讨论

　　目前对于胃癌腹腔内微转移的研究多集中在检查腹腔灌洗液的肿瘤标志物水平上，包括PLC、常规方法和逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)。PLC检查比较常用，但敏感性较差，本研究62例患者阳性率仅为14.52%。应用化学发光酶联免疫法和RT-PCR技术检测腹腔冲洗液敏感性较高，但可产生较多假阳性结果[2]。另外，腹腔灌洗液检测到肿瘤细胞只能说明游离肿瘤细胞的存在[3]，并不能直接证实发生了微转移。

　　术中腹膜取材检测微转移的研究较少，主要方法有免疫组织化学和RT-PCR。后者敏感度较高，但会有一定的假阳性率，对技术要求较高和价格昂贵，限制了其在临床上的应用。Yamamoto等[4]认为分子水平检测阳性不能明确诊断癌细胞存在。免疫组织化学方法是临床上比较成熟的技术，常用的指标是CK。CK分布于上皮细胞的中间纤维丝，作为一种细胞骨架成分，有维持细胞形态和运动、调节细胞分化、参加细胞器定位等功能。在恶性肿瘤的异常增生过程中，CK可发生一系列的改建重组以适应细胞形态和功能的变化，其中CK19 及CK20 在胃肠道上皮性肿瘤中有较高表达。目前应用CK19及CK20检测胃癌微转移，其灵敏性和特异性已得到广泛认同[5]。本研究取腹膜组织做CK19、CK20免疫组织化学染色可以直观地检测到转移的肿瘤细胞。

　　胃周围系膜具有高度的组织同源性。在胚胎时期，胃腹侧系膜在前肠旋转中形成小网膜，胃背侧系膜的前后两层则广泛覆盖胃、脾、胰腺，衍化成为大网膜、胃脾韧带、胰腺被膜等。在胚胎时期前肠旋转中，胃周围系膜与系膜、系膜与脏器和后腹壁相互靠近并贴在一起发生融合，形成潜在的、分布广泛的、充满淋巴组织和疏松结缔组织的间隙[6]。胃癌比较容易通过此组织间隙发生浸润和淋巴转移，当前胃癌根治术中剥离横结肠系膜前叶和胰腺被膜已逐渐成为常规，有学者提出了对进展期胃癌行“胃全系膜切除术”或“网膜囊完整切除”，是将网膜囊的后壁与前壁及胃(包括周围淋巴脂肪组织)一并整块切除，以达到根治的目的[7-8]。但由于缺乏较为可靠的理论依据，且剥离操作易进入错误分离层面，造成出血、系膜剥离不全、术后淋巴瘘、胰瘘等，故是否应用此术式存在不同观点。本研究证实进展期胃癌患者横结肠系膜前叶、胰腺被膜和胰腺上方的网膜囊后壁组织内存在微转移灶，并且微转移发生概率与肿瘤侵透浆膜等因素相关。因此对于进展期胃癌，尤其是肿瘤较大、侵透浆膜者，应该剥离横结肠系膜前叶、胰腺被膜和胰腺上方的网膜囊后壁，争取做到“网膜囊完整切除”，方能保证手术的根治性。

　　本研究采用多点取材，提高了腹膜微转移的检出率。62例患者共检出27例，占43.55%，较以往文献报道的阳性率明显提高，而4处腹膜组织单独检测的阳性率与以往文献数据相当。肿瘤穿透浆膜层患者 36 例，发生微转移者23 例，阳性率占 63.89% ，明显较未穿透浆膜者(15.38% )高。肿瘤直径≥5 cm者阳性率明显高于<5 cm者。肿瘤发生淋巴转移者微转移阳性率较淋巴结阴性者高，推测肿瘤穿透浆膜的面积越大，越容易有肿瘤细胞脱落到腹腔形成转移灶。本研究显示，4例胃癌腹膜微转移阳性患者肿瘤原发灶并没有发展到穿透浆膜层，但发生了淋巴结转移，说明淋巴转移在胃癌腹膜扩散中占据一定地位。日本学者Tanaka等[9]报道，癌细胞脱落种植并非腹膜转移的唯一途径，胃癌可通过淋巴途径向腹膜扩散，本研究结论一致。4种不同部位腹膜微转移阳性率以横结肠系膜前叶和胰腺被膜最高，均高达35.48%;盆底腹膜最低，为25.81%，但相关分析发现差异无统计学意义，故不能判定腹膜微转移的好发部位和次序。

　　总之，胃癌病理研究可以直接指导临床治疗方案的制定，并与患者肿瘤复发、转移及预后密切相关。在胃癌根治术中，建议常规取腹膜组织做免疫组织化学染色，以检测有无微转移，多点取材有助于提高检出率。对于肿瘤侵透浆膜面积较大、术中探及淋巴结肿大者，应该高度警惕微转移的存在。若能发现更灵敏的标志物，并通过腹腔镜或他它途径于术前行腹膜微转移检测，将会更好地指导手术设计和术后治疗。

【参考文献】      [1] Raj GV, Moreno JG, Gomella LG, Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors[J]. Cancer, 1998,82 (2):1419-1442.

　　[2] Kodera Y, Nakanishi H, Ito S, et al. Prognostic significance of intraperitoneal cancer cells in gastric carcinoma:detection of cytokeratin 20 mRNA in peritoneal washes,inaddition to detection of carcinoembryonic antigen[J]. Gastric Cancer, 2005,8(3):142-148.

　　[3] Kodera Y, Nakanishi H, Ito S, et al. Detection of disseminated cancer cells in linitis plastica-type gastric carcinoma[J]. Jpn J Clin Oncol, 2004,34(9):525-531.

　　[4] Yamamoto N, Kato Y, Yanagisawa A, et al. Predictive value ofgenetic diagnosis for cancer micrometastasis:histologic and experimental appraisal[J]. Cancer, 1997, 80(8):1393.

　　[5] Chen XM, Chen GY, Wang ZR, et al. Detection of micrometastasis of gastric carcinoma in peripheral blood circulation[J]. World J Gast roenterol, 2004, 10(6):804.

　　[6] 徐恩多，舒强.胃癌根治术的胚胎解剖学基础[J].普外临床，1991，6(6):358-362.

　　[7] 李新民，周勇.胃癌根治术中完整切除网膜囊的临床意义[J].临床外科杂志，2007，15(8)：561-562.

　　[8] 刘玉村，高红桥，万远廉.胃全系膜切除术治疗胃癌[J].中华胃肠外科杂志，2003，6(3)：206-207.

　　[9] Tanaka T, Kumagai K, Shimizu K, et al. Peritoneal metastasis in gastric cancer with particular reference to lymphatic advancement ;extranodal invasion is a significant risk factor for peritoneal metastasis[J]. J Surg Oncol, 2000,75(3):165-171.