原发性肝癌患者细胞因子水平的变化与转移和复发的关系

原发性肝癌患者细胞因子水平的变化与转移和复发的关系

(滕木俭,王明海)

 1山东省千佛山医院普外中心  肝胆外科  （山东  济南  250014）

 2山东大学医学院  （山东  济南  250012）

           【关键词】  肝肿瘤 白细胞介素1 白细胞介素4 干扰素Ⅱ型 肿瘤转移 肿瘤复发,局部

     【摘要】目的：观察原发性肝癌患者细胞因子IL4、IFNγ、IL1β在肝癌组织中的表达，探讨细胞因子的变化、漂移与肝癌转移和复发的关系。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测并比较肝癌组和对照组细胞因子IFNγ（Th1）、IL4（Th2）、IL1β的水平。结果：34例肝细胞性肝癌患者与15例单纯肝硬化患者相比，肝癌组织中IFNγ（Th1）的表达强度、阳性表达频度较对照组明显降低，分别为0.92±0.36（18/34，53.9%）和1.63±0.64（12/15，80.0%）（P＜0.01）。IL4（Th2）在肝癌组织中的表达强度较对照组明显增强，分别为1.76±0.49和1.01±0.51（P＜0.01）。IL1β在肝癌组织中和对照组的表达强度及频度分别为1.01±0.32（30/34，88.2%）和0.35±0.30（4/15，26.7%）（P＜0.001）。3种细胞因子在肝癌组织中有5种不同表达方式。结论：原发性肝癌患者的抗肿瘤免疫存在严重缺陷，细胞因子间的平衡被打破，使已处于抑制状态的Th细胞免疫更趋恶化，致使肿瘤细胞容易发生肝内转移及术后复发。

       The relationship between immunoregulatory cytokines and intrahepatic metastasis and recurrence in primary hepatocellular carcinoma

    TENG Mujian1,WANG Minghai2,PAN Leyu2

    1Department of Hepatobiliary Surgery of General Surgery Center,Qianfoshan Hospital of Shandong Province(Jinan 250014,China)

    2Medical College of Shandong University(Jinan 250012,China)

    【ABSTRACT】Objective:To observe the expression of immunoregulatory cytokines including interleukin4(IL4,Th2)、 interferonγ(IFNγ,Th1)、interleukinbetal (IL1β) in the tissues of hepatocellular carcinoma(HCC),and to investigate the relationship between the changes of immunoregulatory cytokines in patients with hepatocellular carcinoma and intrahepatic metastasis and recurrence.Methods:The immunoregulatory cytokines:IFNγ(Th1)、IL4(Th2)、IL1β were analyzed by RTPCR.Results:34 cases with HCC were compared with the ones with liver cirrhosis,the expression rates and density of IFNγ(Th1) in the tissues of hepatocellular carcinoma were much lower than that in the liver cirrhosis,they are 0.92±0.36(18/34,53.9%) and 1.63±0.64(12/15,80.0%),respectively.There is significant difference between them (P＜0.01).The expression density and levels of IL4(Th2) in the tissues of hepatocellular carcinoma increased clearly,compared with the control group.They are 1.76±0.49 and 1.01±0.51,respectively.Their difference showed statistical significance (P＜0.01).The expression rates and levels of IL1β in the tissues of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis were 1.01±0.32(30/34,88.2%) and 0.35±0.30(4/15,26.7%),respectively.There was significant difference between them (P＜0.001).Above three immunoregulatory cytokines in patients with hepatocellular carcinoma showed five different expression styles.Conclusion:There is severe deficiency of immune responses against tumors in patients with hepatocellular carcinoma,the balance between those above immunoregulatory cytokines was destroyed,so that immune responses against tumors were weaker and in further suppression,which may enhance the incidence rates of intrahepatic metastasis and recurrence of hepatocellular carcinoma after operation.

    【KEY WORDS】Liver neoplasms?Interleukin1?Interleukin4?Interferon typeⅡ?Neoplasm metastasis?Neoplasm recurrence,local

    我国肝癌患者大多合并严重肝硬化，机体免疫状态已发生某些改变，并且容易发生肝内及远处转移。肝脏局部、全身免疫状态和抗肿瘤免疫与原发性肝癌复发及转移关系的研究已取得一些进展［1~3］。肿瘤免疫研究占据重要位置［4~6］。本研究应用RTPCR法对肝癌组织细胞因子进行检测，以探讨肝细胞癌患者免疫状态改变及其与肝癌转移和复发的关系。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  肝细胞性肝癌（HCC）组织均来源于我院2000年3月到2002年3月手术切除标本，均经术后病理证实，肝硬化组织来源于同期门脉高压症手术肝活检。其中肝细胞性肝癌组（肝病组）34例，男23例，女11例，年龄35~71岁，中位年龄43岁；门脉高压症肝硬化组（对照组）15例，男11例，女4例，年龄29~63岁，中位年龄37岁。

    1.2  方法

    1.2.1  标本收集处理  （1）部分标本离体后均迅速切取多块小组织，30min内浸入液氮中，之后转移到-80℃冰箱中冻存备用；（2）所有标本均行常规病理检查及分类。

    1.2.2  细胞因子IL4、IFNγ、IL1β的测定  RTPCR检测细胞因子试剂盒（瑞士Rochr公司产品）：CIT变性液10ml，2MNaOAC（pH4.0，600μl），MMLV逆转录酶200U/μl（20μl）；逆转录反应体系（RT reaction buffer），Taq DNA聚合酶1U/μl（40μl），PCR反应体系（PCR reaction buffer），去Rnase水。

    提取总RNA：（1）100mg标本剪碎后加500μl CIT变性液，在匀浆器内匀浆，若为细胞标本，吹打即可，加入50μl 2M NaOAC、500μl水饱和酚、100μl氯仿，每步均需要混匀10s，冰浴5~15min。（2）4℃10000g离心10min，小心吸取上清移入新Eppenderf管中，切忌吸入蛋白，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h。（3）4℃12000g离心10min，弃上清，沉淀使用100μl CIT变性液重溶，加入等体积异丙醇混匀，-20℃放置1h。（4）4℃12000g离心10min，弃上清，用75%乙醇洗一遍，至此可加入1ml无水乙醇于-70℃储存备用，亦可直接凉干，溶于适量无Rnase的去离子水中。（5）紫外分光光度计测出A260及A280的值，计算所提总RNA的含量。

  逆转录（RT）反应：DEPC处理0.5ml于Eppendorf管中，加入逆转录反应体系试剂，快速离心混匀，37℃，1h，95℃，10min灭活MMLV，快速离心沉淀。

    PCR反应：在上述20μl RT产物的0.5ml Eppendorf管中，继续加入PCR反应体系试剂，快速离心混匀，加入100μl液体石蜡。循环条件：94℃ 1min，72℃ 1min，循环35次，末次延长7min，电泳鉴定。定量分析：用凝胶成像分析系统判定阳性细胞因子和βactin表达强度。见表1。表1  RTPCR检测相关细胞因子的引物序列（略）

    2  结  果

    2.1  肝细胞肝癌组织细胞因子表达强度和频度  见表2、表3。表2  肝细胞癌肝组织细胞因子表达强度（略）表3  肝细胞肝癌组织细胞因子表达频度

　 2.2  肝癌细胞各细胞因子的表达模式  见表4。表4  肝细胞癌肝癌细胞中细胞因子的表达模式

    3  讨  论

　肿瘤的发生、发展和免疫逃逸及其与各细胞因子间的关系近年来倍受关注，为此我们对原发性肝癌肝组织中细胞因子IFNγ（Th1细胞因子）、IL4（Th2细胞因子）、IL1β的表达模式和强度进行了较系统的研究，并以肝硬化肝组织做对照。本研究发现肝癌组织中IFNγ的表达强度（0.92±0.36）、频度（18/34，53.9%）较对照组（1.63±0.64，12/15，80.0%）明显降低；IL4肝癌组织中的表达强度（1.76±0.49）较对照组（1.01±0.51）明显提高；而肝癌组IL4表达率（33/34，97.1%）较对照组（13/15，86.7%）稍高，IL4/IFNγ肝癌组显著增高，几乎是对照组的3倍，比值达1.87。表明原发性肝癌患者的抗肿瘤免疫存在严重缺陷，细胞因子间平衡被打破，由于IFNγ抑制Th2细胞增殖作用减弱，IL4、IL10抑制Th1细胞因子合成增加，促使Th0细胞向Th2方向分化，而Th0细胞向Th1方向分化被抑制，发生由Th1向Th2漂移，造成免疫抑制状态，机体的抗肿瘤免疫受到严重干扰。尤其伴有门静脉癌栓或肝内转移者IL4/IFNγ比值为2.18，明显高于不伴有门静脉癌栓或肝内转移患者（1.27±0.35），进一步表明由于在启动阶段Th1的极化受抑，使IL4的活性相对占优势，导致Th0向Th2的极化加强。Th2分泌的抑制型细胞因子如IL4、IL5等，可能使肝癌细胞更容易逃避免疫监视，发生转移和复发。Yamamura等［7］和Kharkevitch等［8］最先发现肿瘤患者体内以Th2型细胞占优势状态，之后发现非小细胞肺癌、绒膜癌、脑胶质瘤、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌、淋巴癌等多种类型肿瘤发生Th2漂移。Tsukui［9］等检测了144例人乳头瘤病毒（HPV）感染后出现不同宫颈病变的妇女末梢血中IL2的生物活性状况，结果25例HPV DNA阳性但病理检查正常，66例轻度鳞状上皮病变（LSIL）、21例高度鳞状上皮病变（HISL）和28例侵袭性宫颈癌患者体内IL2的应答率依次是35%、17%和7%，随病情加重出现明显的Th1下降现象。本组研究结果显示，近47%（16/18）肝癌患者IFNγ呈阴性，即使IFNγ呈阳性，其表达相对较弱，表明尽管肿瘤特异性CDTh细胞在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，但这种作用可受到肿瘤的抵抗，肿瘤可诱导特异性Th细胞无反应性，不产生IFNγ、IL2、TNFβ等细胞因子或减弱其分泌能力。以前研究认为，肿瘤患者Th1/Th2的漂移主要发生末梢血单个核细胞或肿瘤浸润淋巴细胞上，最近以肿瘤细胞株进行的研究表明，肿瘤细胞本身也出现Th2型细胞因子模型，本组研究结果进一步证明了这一点。IL1β与免疫状态及肿瘤细胞免疫逃逸的关系，以往仅把IL1β作为炎性细胞因子对待，近来发现其功能远非如此。本研究发现IL1β在肝癌组织中的表达强度、频度为1.01±0.32和30/34（88.2%），在对照组的表达为0.35±0.30、4/15（26.7%）（P＜0.01），伴有门静脉癌栓或肝内转移者IL1β明显高于肝癌组均值（P＜0.01），且几乎是不伴有门静脉癌栓或肝内转移者的2.5倍（P＜0.001），其表达的强度和表达的阳性率增高有明显差异。由此我们认为IL1β可能对IFNγ有抑制作用，使本已处于抑制状态的Th细胞免疫更趋恶化，使肿瘤细胞易于发展及转移，这可能是为什么临床上应用干扰素、IL2等Ⅰ型细胞因子效果不佳的主要原因。此外，IL1β对VEGF有明显上调作用［11］，促使肿瘤血管生成，使肿瘤与微血管的接触面积加大，造成原发性肝癌的过早肝内转移，与我们的研究结果基本一致。因此，可以认为IL1β的产生对抑制或减少肿瘤的发生、发展和转移具有重要的意义。目前对细胞因子与传统的临床检验项目不同，检测Th1/Th2相关细胞因子不能仅着重于辅助疾病的诊断，而应更注重于分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th2失衡，提供正确的治疗措施。

    参  考  文  献

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    ［3］韩丽辉，孙汶生，贾晓青，等.γ干扰素对HBV相关性肝癌细胞凋亡的免疫调节效应研究［J］.中国现代普通外科进展，2005,8（5）:269271.

    ［4］张彩，田志刚.肿瘤免疫逃逸机制的研究进展［J］.国外医学肿瘤分册，2000，27（2）：7779.

    ［5］Okudak,Ohtsuki J,Obata H,et al.Natural history of hepatocellular carcinoma and prognosis in relation to treatment:study of 850 patients［J］.Cancer,1985,56:918928.

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