血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶

血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶

(周天保,杨广顺 )     上海市第二军医大学附属东方肝胆外科医院  胆道二科  （上海  200433）       【关键词】  肝肿瘤 血管内皮生长因子 明胶酶β 微血管密度?肿瘤转移

    【摘要】目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达与原发性肝细胞癌（PHCC）侵袭和转移的关系。方法：采用免疫组织化学LSAB法和原位杂交法对40例PHCC和癌旁组织手术切除后的石蜡标本组织中的VEGF和MMP9的表达及微血管密度（MVD）进行了检测。结果：①VEGF、MMP9表达与MVD、PHCC组织中明显高于癌旁组织；②在PHCC中，有转移者及包膜不完整者VEGF、MMP9表达与MVD明显高于无转移者及包膜完整者；③VEGF、MMP9表达与MVD在大肿瘤（直径＞5cm）与小肿瘤（直径≤5cm）两者差异无统计学意义；④VEGF的表达与MVD呈正相关。结论：原发性肝细胞癌组织中的VEGF、MMP9表达与肿瘤的侵袭和转移行为密切相关，可作为判定HCC发生、转移及预后的指标。

    【关键词】肝肿瘤 血管内皮生长因子 明胶酶β 微血管密度?肿瘤转移

      The expression and clinical significance of VEGF and MMP9 in primary hepatocellular carcinoma

    ZHOU Tianbao,YANG Guangshun

    Department of Biliary Tract Surgery,Easten Hepatobiliary Surgery Hospital Attached to the second Military Medical University(Shanghai 200433,China)

    【ABSTRACT】Objective:To study the relationship between the expression of VEGF and MMP9 with invasion,metastasis of primary hepatocellular carcinoma(PHCC).Methods: Paraffinembedded specimens from 40 patients with PHCC undergoing radical resection were studied.Agiogenesis was assessed by the expression of VEGF,MMP9 and MVD using LSAB immunohistochemical staining and in situ hybridization.Results:①The level of VEGF,MMP9 expression and MVD in PHCC was higher than that in the paratumorous tissue(P＜0.01).②The level of VEGF,MMP9 expression and MVD in tumor with tumor metastasis or in nonencapsulated tumors were higher than that in tumors without metastasis or in wellencapsulated tumors(P＜0.05).③There was no significant difference in the level of VEGF,MMP9 expression and MVD between large PHCC(diameter ＞5cm) and small ones (diameter≤5cm)（P＞0.05）.④The expression of VEGF was positively correlated with MVD(P＜0.01).Conclusion:The expression of VEGF,MMP9 and MVD are highly correlated with invasion and metastasis in PHCC,which may serve as a parameter for determining tumor metastasis and prognosis.It may be a new idea to supervise and treat HCC.

    【KEY WORDS】Liver neoplasms?Vascular endothelial growth factor?Gelatinase β?Density?Neoplasm metastasis        原发性肝细胞癌（PHCC）转移率和复发率高，其中以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9,MMP9）为代表的促进微血管生成的因子及蛋白水解酶系统起着重要作用。本文从此角度来研究PHCC，以期对PHCC的发生、发展、转移及预后能有进一步了解。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  手术切除经病理证实为原发性肝细胞癌的标本40例，男29例，女11例，年龄35~60岁（中位年龄45.6岁）。肿瘤直径＞5cm者占45%（18/40），≤5cm者占55%（22/40）。包膜完整者占37.5%(15/40)，包膜不完整者占62.5%(25/40)。有肝外脏器转移和/或有门静脉癌栓或肝门淋巴结转移者占57.5%(23/40)，无转移者占42.5%(17/40)。对照组为手术中取自肿瘤边缘以外的部位经HE染色病理切片证实无癌变的组织。

    1.2  方法  原位杂交试剂盒（博士德公司），CMIAS真彩色医学图像分析系（北京），兔抗人VEGF多克隆抗体（丹麦Dako公司），兔抗人第8因子相关抗原多克隆抗体（F8RA）（丹麦Dako公司），LSAB试剂盒（丹麦Dako公司）。LSAB免疫组化染色按参考文献1进行，原位杂交按试剂盒说明书进行操作。

    1.3  统计方法  VEGF、MMP9表达、MVD与各临床因素之间分析用卡方精确检验法，VEGF、MMP9表达与MVD之间关系用相关分析。

    2  结  果

    2.1  阳性结果判定  VEGF、MMP9：VEGF、MMP9阳性细胞为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，分布于胞浆。在显微镜100倍视野下随机选择5个阳性细胞最密集区，再在400倍视野下，转换到CMIAS真彩色医学图像分析仪并在屏幕上进行阳性肿瘤细胞计数，当阳性肿瘤细胞≥5%定为阳性，＜5%定为阴性。MVD凡在肿瘤细胞组织中与邻近微血管和肿瘤细胞分界清楚，并被染成棕黄或棕褐色的内皮细胞或内皮细胞簇团，均认为是新生的肿瘤血管。计数方法：在放大100倍视野中，随机选择5个新生血管最密集区，再在400倍视野下进行计数，取其均数，即为新生血管数。

    2.2  检测结果

    2.2.1  VEGF表达  在PHCC组织中总VEGF表达率为70.0%(28/40)，而癌旁组织中为20%（8/40）（P＜0.01），并且癌旁组织阳性表达者中着色较弱、较淡。见图1。PHCC有转移者中VEGF表达率为45.0%(18/23)，无转移者为17.5%(7/17)（P＜0.05）。在包膜不完整者中VEGF表达为76.0%(19/25)，包膜完整者中为40.0%(6/15)(P＜0.05)；直径＞5cm肿瘤者中VEGF表达为55.6%(10/18)，直径≤5cm肿瘤者为50.0%(11/22)(P＞0.05)。见表1。

    2.2.2  VEGF mRNA、MMP9 mRNA表达  PHCC组织中VEGF mRNA表达为0.43±0.04,癌旁组织为0.24±0.06(P＜0.01)。PHCC组织中MMP9mRNA表达为0.41±0.05，癌旁组织中为0.22±0.03(P＜0.01)。VEGFmRNA、MMP mRNA表达与临床病理学各参数关系见表2。表1  PHCC中VEGF表达、MVD与病理学参数关系

2.3  MVD  MVD在PHCC中为21.1±8.6，在癌旁组织中为7.8±3.4(P＜0.01)。MVD与临床病理学各参数关系见表1。 表2  PHCC中VEGF mRNA、MMP9mRNA与临床病理学参数关系

    3  讨  论

　恶性肿瘤的生长、侵袭及转移过程受多种因素的影响。近来研究表明，肿瘤新生微血管形成和血管基底膜的蛋白酶在侵袭、转移过程中起着十分重要的作用［2］。VEGF是促进血管生成的惟一特异的生长因子，通过选择性直接作用于血管内皮细胞上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体flt1和KDR/flk1而发挥作用。它既可由一些正常细胞产生和分泌，也可由肿瘤细胞产生［3］。但VEGF在健康成人组织中仅维持正常的血管密度和基本的渗透功能，以利于营养物质的运输，而在许多肿瘤组织中均有较高水平的表达，如在脑肿瘤、结肠癌［4］、胃癌［5］、前列腺癌、甲状腺癌中均与肿瘤生长、转移密切相关。MMPs为基质降解酶，能降解细胞外基质及基质膜，促进癌细胞的局部侵袭性与远处转移。它是一类蛋白结构相近、编码基因与胶原酶基因同源的蛋白分解酶家族，MMP9是其中的一员。它最主要的功能是降解和破坏细胞外基质中最主要的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶［1，6，7］。本研究结果显示，VEGF、MMP9在癌灶组织的阳性表达远高于癌旁组织，说明VEGF、MMP9表达与肿瘤关系极为密切，VEGF、MMP9表达水平有转移组明显高于无转移组，包膜不完整组与包膜完整组差异亦有显著性。提示VEGF、MMP9表达可作为监测肝肿瘤转移的一项指标。第Ⅷ因子（F8）为常用的血管内皮细胞标记物，它是血浆中Ⅷ因子的一种高分子亚基，是一种糖蛋白［8］。本实验中发现，PHCC的MVD明显高于癌旁组织，VEGF与MVD之间呈正相关关系，证实VEGF促血管生成的作用［9］。因此，抗肿瘤血管生成将成为抑制肿瘤生成和转移的新的治疗策略［10］。

　参  考  文  献

    ［1］Nakagawa Y,Fujimoto J,Tamaya T.Factor and basic fibroblast growth factor,throughout gestation［J］.Gynecol Endocrinol,2004,19(5):259266.

    ［2］任学群，景红，傅侃达.血管内皮生长因子的表达和微血管密度与结直肠癌侵袭转移的关系［J］.中国现代普通外科进展,2004,7(4):220222.

    ［3］Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesisdependent［J］?J Natl Cancer Inst,1991,82(1):411.

    ［4］姜金波，朱民，寿楠海.VEGFC表达对结肠癌预后的影响［J］.中国现代普通外科进展，2005，8（6）：346348.

    ［5］孟海伟，毕玉顺，邢子英，等.VEGFC在胃癌组织及胃癌细胞株SGC7901中的表达及其意义［J］.中国现代普通外科进展，2004，7（6）：353355.

    ［6］Lelongt B,Trugnan G,Murphy G,et al.Matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 are produced in early stages of kidney morphogenesis but only MMP9 is required for renal organogensesis in vitro［J］.J Cell Boil,1997,136:13631373.

    ［7］汪浩，景在平.腹主动脉瘤发病机理的实验研究?Ⅱ?基质金属蛋白酶9在大鼠腹主动脉瘤模型中的动态表达［J］.中国现代普通外科进展，2002，5（4）：213216.

    ［8］许良中.实用肿瘤病理方法学［M］.上海：上海医科大学出版社，1997.402.

    ［9］GilBazo,I Catalan Gonzalez V,Alonso Gutierrez A,et al.Impact of surgery and chemotherapy on von Willebrand factor and vascular endothelial growth factor levels in colorectal cancer［J］.Clin Transl Oncol,2005,7(4):150155.

    ［10］CayeThomasen P,Werther K,Nalla A,et al.VEGF and VEGF receptor1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate［J］.Otol Neurotol,2005,26(1):98101.