氧化苦参碱抑制人肝癌细胞EGF和EGFR表达的研究

作者:王文奇,刘倩,徐瀚峰,时昌  【关键词】  氧化苦参碱  表皮生长因子  受体  表皮生长因子 癌  肝细胞

    【摘要】目的：探讨氧化苦参碱对人肝癌细胞EGF及EGFR表达的影响。方法：将肝癌细胞株BEL7402在37℃、5%CO2条件下培养、传代。按氧化苦参碱浓度分为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml 3组，对照组不加氧化苦参碱，每组设6个平行孔，每孔加入细胞1×105/ml，培养24h、48h和72h，分别进行EGF及EGFR的免疫组化染色。结果：不同浓度的氧化苦参碱均抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达，随着培养时间的延长，EGF和EGFR表达阳性率下降显著，在1000μg/ml组24h、48h和72h的EGF和EGFR阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率下降显著（P0.05,P0.01）。500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异。结论：氧化苦参碱对EGF和EGFR的抑制途径可能是其抗肝癌机制之一。

    【关键词】氧化苦参碱?表皮生长因子?受体，表皮生长因子?癌，肝细胞

      Inhibiting effect of oxymatrine on the expression of EGF and EGFR in human hepatocellular carcinoma cells in vitro

    WANG Wenqi,LIU Qian,XU Hanfeng,SHI Changwen,WU Hongwen

    Deparement of Gastroenterology,Shandong Qianfoshan Hospital (Jinan 250014,China)

    【ABSTRACT】Objective:To investigate the effect of oxymatrine on EGF and EGFR expression in human hepatocellular carcinoma cells,BEL7402.Methods:BEL7402 cells were cultured under the condition of 37℃,5%CO2.BEL7402 cells were treated by oxymatrine with different concentration,including 1000μg/ml,500μg/ml,250μg/ml,and 0μg/ml,and the observation period was from 24h to 72h.Four groups were divided.Each group contains six wells.There are 1×105/ml cells in each well.The expression of EGF and EGFR were observed with immunohistological technique.Results:The expression of EGF and EGFR were suppressed by oxymatrine with different concentration and variable durations.In Group A(1000μg/ml),the expression of EGF and EGFR at 24h,48h and 72h decreased more significantly than Group B(500μg/ml),and Group C(250μg/ml) (P0.05,P0.01).There were no significant difference between EGF and EGFR expression at the different treating durations in Group B and Group C.Conclusion:Oxymatrine can play a certain role in treatment of liver cancer through inhibiting the expression of EGF and EGFR.

    【KEY WORDS】Oxymatrine?Epidermal growth facter?Receptor,epidermal growth facter?Carcinoma,hepatocellular    表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）对肝癌的发病有一定的促进作用。近年研究表明，氧化苦参碱具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞调亡［1］、抗纤维化等作用［2］，今观察其对人肝癌细胞EGF及EGFR表达的影响，报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料  人肝癌细胞系BEL7402 由山东省医科院免疫室提供。氧化苦参碱粉由正大天晴有限公司提供（批号20040920），用生理盐水配成需要浓度。RPMI1640细胞培养液为美国Gibco公司产品。即用型鼠抗人EGFR单克隆抗体与鼠、兔通用型SP试剂盒和联苯二氨（DAB）显色试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，浓缩型兔抗人EGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，用抗原稀释液1∶30稀释后使用；小牛血清为天津TBD公司产品。

    1.2  细胞培养  将肝癌细胞株BEL7402 培养于含10%小牛血清的PRIM1640培养液中，内加青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml，37℃、5%CO2条件下在75细胞培养瓶中培养、传代，分装于多个培养瓶，采用处于对数生长期的细胞进行实验。

    1.3  分组  按照氧化苦参碱的浓度不同分为3组，即1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml，对照组不加氧化苦参碱，每组设6个平行孔，每孔加入细胞1×105/ml，加入不同浓度氧化苦参碱后培养24h、48h和72h，分别进行EGF及EGFR的免疫组化染色。

    1.4  EGF及EGFR的免疫组化  收集3种浓度氧化苦参碱处理过的细胞，配成1×106/ml悬液，取两滴细胞悬液于紫外线照射2h后的载玻片上，放入湿盒，置于37℃、5%CO2培养箱中，细胞爬片生长4h后，置于4℃1∶1甲醇；丙酮中20min固定。PBS清洗，每张载玻片加50μl非免疫性动物血清封闭，37℃孵育30min，分别在每张载玻片加入50μl EGF、EGFR，4℃过夜，加入50μl生物素标记的二抗，37℃孵育1h后，加入50μl亲和素过氧化物酶溶液，37℃孵育40min，加100μl新鲜配制的DAB显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分色，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

    1.5  镜下观察  EGF阳性细胞为胞浆染成棕黄色颗粒，EGFR阳性细胞为胞膜染成棕黄色。200倍视野计数200个细胞，计算5个视野的平均阳性细胞率，然后计算每组中EGF、EGFR平均阳性细胞率。

    1.6  统计学方法  所得数据均用x±s表示，采用SPSS12.0统计学软件进行分析，方差分析以P0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  氧化苦参碱对EGF表达的影响  见表1。不同浓度的氧化苦参碱均抑制EGF在人肝癌细胞的表达，随着培养时间的延长，EGF阳性率下降显著。1000μg/ml组24h、48h和72h的EGF阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率下降显著（P0.05,P0.01），500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异。72h和48h EGF阳性表达率较24h阳性率明显下降（P0.05，P0.01)，72h与48h阳性表达率差异无统计学意义。

    2.2  氧化苦参碱对EGFR表达率的影响  见表2。不同浓度氧化苦参碱均可抑制EGFR在人肝癌细胞的表达，且随着培养时间的延长，EGFR阳性率下降显著。1000μg/ml组各时段的EGFR阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组阳性率下降显著（P0.05,P0.01），500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异；72h较24h EGFR阳性表达率下降显著（P0.05）,24h和48h、48h和72h的阳性表达率无明显差异。

   3  讨  论

    EGF和EGFR在正常细胞分裂增殖和恶性转化中具有重要作用［3］。实验表明，EGFR在大鼠肝癌形成过程中第4周即有表达，吴晓英等发现人肝癌组织中EGF和EGFR的阳性率显著高于癌旁和癌远部［4］，而且EGFRmRNA阳性率在肝癌组织中显著高于癌旁组织中，EGFRmRNA在肝癌组织中阳性率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发等明显相关［5］，EGF可通过增加S期肝癌细胞数量来上调EGFR［6］。

    近年研究发现，氧化苦参碱除具有良好的抗HBV和HCV的作用外［7］，尚有改善肝细胞功能，抗肝纤维化，调节免疫功能，清除自由基，抗肿瘤等作用，其抗肿瘤作用已逐渐引起重视。氧化苦参碱可抑制细胞进入S期，从而使细胞在  表1  3种浓度氧化苦参碱对EGF表达率的影响 24h组G1期堆积，又可促进G2期细胞进入M期；对人肝癌细胞系SMMC7721研究发现，氧化苦参碱作用后可增加G0/G1期细胞所占比例，阻止细胞进入S期，最终使肿瘤的增殖速度受到抑制［8］。

    本研究采用不同浓度的氧化苦参碱作用于人肝癌细胞，观察EGF和EGFR阳性细胞率的变化，发现3种浓度的氧化苦参碱均可抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达，1000μg/ml组作用最强；随着培养时间的延长，EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达率下降明显，72h抑制作用最强，在1000μg/ml组阳性率下降尤为明显，提示氧化苦参碱抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达呈明显浓度及时间依赖性，与文献报告一致［8］。本研究结果表明，氧化苦参碱抑制EGF和EGFR表达需要较高浓度，而且需要一定时间才能发挥更大作用。氧化苦参碱可能直接抑制EGF对肝癌细胞的增殖作用，使其不能对EGFR发挥上调作用；氧化苦参碱本身也抑制肝癌细胞进入S期，二者共同作用最终抑制肝癌细胞增殖。但氧化苦参碱对EGF和EGFR的抑制途径及机制尚未完全明确。

    参  考  文  献

    ［1］胡聪，韩聚强，修贺明.氧化苦参碱及苦参碱对大鼠肝细胞凋亡的影响［J］.中华传染病杂志，2003,21（1）5052.

    ［2］Shi GF,Li Q.Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechanism in vivo［J］.World J Gastroenterol,2005,11(2):268271.

    ［3］王文奇，徐瀚峰.表皮生长因子及其受体与肝癌的关系［J］.国外医学肿瘤学分册,2005,32(3):212214.

    ［4］吴晓英,彭隆祥.表皮生长因子及其受体在人原发性肝细胞癌中的表达［J］.湖南医科大学学报，1997,22(6):544546.

    ［5］赵荫农,曹骥,吴飞翔，等.EGFmRNA和EGFRmRNA在肝细胞癌组织中的表达及其意义［J］.癌症,2004,23(7):762766.

    ［6］金志明,王天翔,陈心江,等.表皮生长因子对人肝细胞癌EGFR/DNA表达的影响［J］.上海第二医科大学学报2002,22(6):489491.

    ［7］Wu XN,Wang GJ.Experimental studies of oxymatrine and its mechanisms of action in hepatitis B and C viral infections［J］.Chin J Dig Dis,2004,5(1):1216.

    ［8］钱学敏,李继强,罗鸿予,等.氧化苦参碱抑制SMMC7721细胞增殖的研究［J］.上海第二医科大学学报,2002,22(6):512514.

 山东大学临床医学院  山东省千佛山医院  消化科  （山东  济南  250014）