单核细胞趋化蛋白1基因2518G/A多态性与中国湖南地区汉族人群脑梗死关系的研究

单核细胞趋化蛋白1基因2518G/A多态性与中国湖南地区汉族人群脑梗死关系的研究作者：陈施艳，张志坚，吴秀丽，王志强，王伟，杨期东    作者单位：350005福州，福建医科大学附属第一医院神经内科（陈施艳，张志坚，吴秀丽，王志强，王伟）；中南大学湘雅医院神经内科（杨期东）    【摘要】  目的 探讨单核细胞趋化蛋白1（MCP1）基因2518G/A多态性与中国湖南地区汉族人群脑梗死（CI）的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）、DNA测序等方法检测162例CI患者(CI组)和150名健康对照者(NC组)MCP1基因2518G/A多态性；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组血清MCP1水平。结果 CI组GG、GA、AA基因型频率分别为39.5%、37.0%、23.5%，G、A等位基因频率分别为58.0%、42.0%；NC组GG、GA、AA基因型频率分别为27.3%、39.3%、33.4%，G、A等位基因频率分别为47.0%、53.0%。CI组GG基因型和G等位基因频率显著高于NC组（均P<0.05）。CI组血清MCP1含量［（157.68±11.60）pg/ml］明显高于NC组［（131.82±10.72）pg/ml］（P<0.05）；MCP1基因2518G/A多态位点中含G等位基因者（GG+GA）血清MCP1含量［（149.44±15.71）pg/ml］显著高于非G等位基因携带者（AA）［（134.57±15.84）pg/ml］（P<0.05）。结论 MCP1基因2518G/A位点的G等位基因可能是中国湖南地区汉族人群CI发病的遗传易感基因。携带G等位基因的个体可能通过上调MCP1表达而增加CI的发病风险。     【关键词】  脑梗死；单核细胞趋化蛋白1；基因多态性　　Study  the  relationship between the monocyte  chemoattractant  protein1  gene 2518G/A  polymorphism  and cerebral infarction of Han population in Chinese Hunan district CHEN Shiyan,  ZHANG Zhijian,  WU Xiuli,  et al.Department of Neurology,  the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China    Abstract：Objective  To  investigate the relationship between monocyte chemoattractant protein1 （MCP1） gene 2518G/A polymorphism and cerebral infarction(CI) of Han population in Chinese Hunan district.Methods  The 2518G/A polymorphism in MCP1 gene was detected by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism analysis (PCRRFLP) and DNA sequencing in 162 patients with CI (CI group) and 150 normal controls (NC group). The serum level of MCP1 in the two groups was determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA).Results  In CI group, genotypic frequency of GG was 39.5%, GA was 37.0%, and AA was 23.5%. The allele frequency of G was 58.0% and A was 42.0%. In NC group, genotypic frequency of GG was 27.3%, GA was 39.3%, and AA was 33.4%. The allele frequency of G was 47.0% and A was 53.0%. The frequencies of MCP1 2518GG genetype and G allele in CI group were significantly higher than those in CI group (all P<0.05). The level of serum MCP1 in CI group ［（157.68±11.60）pg/ml］was significantly higher than that in NC group ［（131.82±10.72）pg/ml］ (P<0.05). The people with MCP1 2518G allele (GG+GA) had higher level of serum MCP1 ［（149.44±15.71）pg/ml］than that only with MCP1 2518A allele (AA) ［（134.57±15.84）pg/ml］(P<0.05).Conclusions  The MCP1 gene 2518G/A G allele may be a genetic risk factor for CI of Han populations in Chinese Hunan Hans.The MCP1 2518G allele carrier may has upregulated the expression of MCP1 and hence is a higher risk of CI.    Key words：cerebral infarction;monocyte chemoattractant protein1;gene polymorphism　　脑梗死（CI）的发生具有复杂的遗传和环境因素。研究［1-3］发现，单核细胞趋化蛋白1（MCP1）基因调控区序列多态性位点2518G/A可能与MCP1转录活性有关，而且与动脉粥样硬化、冠心病等的发病有关，但其与CI的关系少见报道。为此，本研究应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术和DNA序列测定法，检测中国湖南地区汉族CI患者及正常人群的MCP1基因2518G/A多态性分布，旨在探索此基因多态与CI发病的关系。1  对象与方法　　1.1  对象  （1）CI组：系2004年2月～2005年9月就诊于中南大学湘雅医院神经内科湖南藉汉族CI患者162例，男99例，女63例；年龄37～89岁，平均（62.3±11.8）岁；病程4 h～19 d，平均(3.2±0.7)d。符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅CT/MRI确诊。排除心源性、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形等原因引起的CI。（2）正常对照（NC）组：为同期在本院体检的无亲缘关系湖南藉汉族健康成人150名，男91人，女59人；年龄35～86岁，平均（61.1±8.9）岁。无卒中家族史，无肝、肾、血液病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病、妊娠及心脑血管病史。　　1.2  方法　　1.2.1  基因组DNA样品制备  抽取入组者外周静脉血5 ml，枸橼酸钠抗凝，常规苯酚氯仿方法抽提基因组DNA。　　1.2.2  PCR 引物制备  引物的序列［1］：上游：5′CCGAGATGTTCCCAGCACAG3′，下游：5′CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT3′。PCR扩增反应体系：20 μl PCR反应体系中，基因组DNA 200 ng，dNTPs 600 μmol/L，上、下游引物各10 pmol，Taq酶0.7 U及其相应的PCR反应缓冲液，适量的灭菌dd H2O。反应条件：94℃预变性5 min，然后按94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，重复31个循环，最后72℃延伸10 min。取10 μl PCR扩增产物，加限制性内切酶PvuⅡ10 U及其相应的酶切缓冲液，每份样品反应的总体积为20 μl，37℃孵育5 h使样品完全酶切。采用2%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）进行电泳，以100 bp Marker为相对分子质量标记，紫外线分析仪观察、拍照并分析其结果。MCP1基因2518G/A位点的扩增产物片段长度为930 bp。纯合子GG型，酶切后出现708 bp和222 bp两种片段；杂合子GA型，酶切后显示930 bp、708 bp和222 bp 3种片段；纯合子AA型，仅显示930 bp 1种片段。　　1.2.3  单核苷酸序列分析  PCR扩增产物经纯化后，在基因测序仪（上海英骏生物技术有限公司）上进行DNA测序。　　1.2.4  MCP1含量测定  取入组者空腹静脉血3 ml，室温下静置0.5～1 h，离心后留取血清，-40℃保存待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中MCP1的含量。试剂盒购自深圳晶美生物工程技术有限公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。　　1.2.5  统计学方法  采用SPSS 11.0软件进行统计分析。按HardyWeinberg平衡法检验样本的群体代表性。基因型和等位基因频率比较采用χ2检验或有关校正方法。数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。2  结果　　2.1  两组MCP1基因2518G/A基因型及等位基因频率的比较  见表1。CI组GG基因型及G等位基因频率明显高于NC组（均P<0.05）。　　表1  两组MCP1基因2518G/A基因型及等位基因频率的比较（略）　　注：与正常对照组比较* P<0.05　　2.2  各组血清MCP1含量的比较  CI组血清MCP1含量为（157.68±11.60）pg/ml，明显高于NC组［（131.82±10.72）pg/ml］（P<0.05）；两组中MCP1基因2518G/A多态位点中含G（GG+GA）等位基因者血清MCP1含量［（149.44±15.71）pg/ml］明显高于非G等位基因携带者（AA）［（134.57±15.84）pg/ml］（P<0.05）。3  讨论　　炎症免疫反应是CI的发病机制之一,多数CI发生在动脉粥样硬化的基础上。动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，其过程涉及了一些炎症免疫介质，尤其是趋化因子发挥了重要作用［4,5］。目前普遍认为，单核细胞在一些趋化因子如MCP1的吸引下聚集于血管内膜，作为动脉粥样硬化的始动因素迁移进入动脉壁。MCP1可引起单核/巨噬细胞胞浆内游离钙水平升高、表达黏附分子(如β2整合素)、释放溶酶体酶及超氧阴离子、组织因子和促炎细胞因子等，导致单核/巨噬细胞的激活与聚集，加重脂质的积累，促进动脉血管内膜细胞增生及动脉斑块的生长［6］。　　MCP1的转录发生在血管损伤早期，白细胞聚集和血管壁变化均可引起血浆MCP1水平增高。人类MCP1基因转录活性似乎是由该基因5′端特定区域控制，这个末端调控区位于转录起始位点上游1.8～2.7Kb处，含有细胞因子诱导MCP1表达时所必须的核转录因子κB（NFκB）结合位点；而且在此5′端基因调控区序列中存在两个位点的基因多态：2518G/A和2076A/T，其中2518G/A是一种功能性基因多态，调控着这个转录启动区域的活性，进而影响MCP1基因的转录活性，与一些刺激因素作用（如细胞因子）诱导单核细胞表达MCP1的个体差异有关［1，7］。　　有研究［3，7］指出，冠心病患者具有相对较高的G等位基因携带频率。Aguilar等［8］的研究发现MCP1基因2518G/A多态性与系统性红斑狼疮患者皮肤血管炎也有一定的相关性。本研究应用PCRRFLP技术和DNA序列测定法，检测中国湖南地区汉族CI患者及正常人群MCP1基因2518G/A多态性分布，结果发现MCP1基因2518G/A多态性与中国湖南地区CI的发病有一定相关性；CI组MCP1基因-2518G/A位点G等位基因频率明显高于NC组，提示G等位基因可能是中国湖南地区汉族人群CI发病的遗传易感基因。　　MCP1基因2518G/A多态性与动脉粥样硬化、冠心病、CI等这些缺血性血管性疾病的关系尚不清楚。Szalai等［3］发现MCP1基因2518G/A多态性与血浆脂蛋白（a）［Lp(a)］的含量有一定的相关性,具有MCP1基因2518G/G基因型者LP(a)的含量及患冠心病的几率均明显高于MCP1基因2518A/A基因型者;而高Lp（a）血症是冠心病、动脉粥样硬化和CI等的危险因素之一［9］。高Lp（a）血症与MCP1基因2518G/G基因型可能是通过提高MCP1的表达，增加白细胞的聚集，从而增加动脉粥样硬化的危险性。但Reape等［10］认为，MCP1也可能是通过促进脂质过氧化引起动脉粥样硬化损伤。有报道［11］心肌梗死患者血清中MCP1的水平增高。本研究发现CI组血清MCP1水平明显高于NC组，MCP1基因2518G/A多态位点含G等位基因者（GG、GA）血清MCP1含量明显高于非G等位基因携带者（AA），差异具有统计学意义（P<0.05）。推测MCP1基因2518G/A多态是通过调节MCP1基因的转录、翻译表达，进而影响CI的发生、发展；MCP1基因2518G/G基因型可上调MCP1的表达，增加单核细胞的聚集，从而增加动脉粥样硬化损害及CI发病的危险性。    本研究发现，MCP1基因2518G/A多态性与中国湖南地区汉族CI发病相关，其中G等位基因可能是中国湖南地区汉族CI患者的遗传易感基因，携带G等位基因的个体可能通过促进相应蛋白的表达或改变蛋白生物学功能，进而增加CI的发病风险。【参考文献】　　［1］Rovin BH, Lu L, Saxena R. 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