胶质细胞系源性神经营养因子对帕金森病大鼠黑质钙结合蛋白表达的影响

胶质细胞系源性神经营养因子对帕金森病大鼠黑质钙结合蛋白表达的影响作者：肖成华，杨华，高殿帅，曹俊平，余景考    作者单位：221002徐州医学院附属医院神经内科（肖成华，杨华）；徐州医学院神经生物学教研室（高殿帅，曹俊平，余景考）    【摘要】  目的 研究胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)对帕金森病（PD）大鼠黑质钙结合蛋白(CB)表达的影响，以及神经细胞黏附分子(NCAM) 在其中的作用。方法 制作PD模型大鼠36只,分为GDNF组、NCAM阻断组和对照组，每组12只。采用免疫组化染色和免疫印迹法,检测各组大鼠黑质CB 阳性细胞数和CB表达量。结果 GDNF组黑质处CB阳性神经元数 (46.50±6.28)及表达量(33770.60±6929.76)明显高于对照组［(27.00±8.60）、（18281.00±5266.78)］（均P<0.05）；与NCAM阻断组［（44.00±13.37）、（30857.00±7484.87）］相比差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 GDNF可上调PD大鼠黑质CB的表达，从而保护受损的多巴胺能神经元, NCAM对这一作用无明显影响。    【关键词】  帕金森病；多巴胺能神经元;胶质细胞系源性神经营养因子;钙结合蛋白;神经细胞黏附分子　　Ｅffect of glial cell linederived neurotrophic factor on the expressing of calbindin D28K in substantia nigra of rat model of Parkinsons disease XIAO Chenghua, YANG Hua, GAO Dianshuai, et al.Department of Neurology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China    Abstract：Objective  To explore the effect of glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF) on the expressing of calbindin D28K (CB) in substantia nigra (SN) of rat model of Parkinsons disease (PD) and the possible role of neural cell adhesion molecule (NCAM) in this course.Methods  36 rat models of PD were made, and divided into GDNF group, NCAM blocked group and control group (each group had 12 rats). Immunohistochemistry and Western blot method were used to detect the number of CBpositive cells and the expressed level of CB protein in SN of rats. Results  The number of CBpositive cells (46.50±6.28) and the expressed level of CB protein (33770.60±6929.76) in SN of GDNF group were significantly higher than control group ［(27.00±8.60）, （18281.00±5266.78） respectively］(all P<0.05). As compared with NCAM blocked group ［(44.00±13.37），（30857.00±7484.87） respectively］, there were no differences between the two groups (all P>0.05). Conclusions  GDNF may protect the injured dopaminergic  neurons through up regulating the expressing of CB, but NCAM is not involved in this mechanism.     Key words：Parkinsons disease;dopaminergic neuron;glial cell linederived neurotrophic factor;calbindin;neural cell adhesion molecule　　已有研究［1，2］证实，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)对中脑多巴胺(DA)能神经元具有很强的保护作用。但是其具体作用机制目前尚不清楚。有研究［3］报道，含有钙结合蛋白D28K（CB）的DA能神经元具有较强的抗变性能力。为此,本研究观察GDNF对帕金森病（PD）模型大鼠中脑黑质CB表达的影响及神经细胞黏附分子(NCAM)在其中的作用。1  材料与方法　　1.1  材料  成年健康雄性 SD大鼠36只,质量200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。制模成功后随机分为GDNF组、NCAM阻断组和对照组，每组12只。人重组GDNF、AntiNCAM、6羟多巴胺（6OHDA）、小鼠抗兔CB多克隆抗体和ABC试剂盒均购于Sigma公司；立体定位仪(KOPF,日本)；封闭用羊血清原液购于北京中山公司。　　1.2  方法　　1.2.1  PD模型鼠制做及处理  将大鼠腹腔内注射戊巴比妥纳(50 mg/kg)麻醉后, 固定在立体定位仪上，按照Paxinos和 Watson（1986）图谱确定黑质坐标点，用Hamiton微量注射器向硬膜下两点各注射6OHDA 6 μg（溶于2 μl生理盐水，含0.02%维生素C），注射速率0.5 μl/min，注射后留针5 min，退针5 min。在注射后第7 d，以行为学分析法判定早期PD模型［4］；制模成功后，对照组大鼠黑质内注射PBS,GDNF组注射GDNF 20 ng（1 μl），NCAM阻断组于注射GDNF前注射 antiNCAM 200 ng（1μl）。注射方法同前。　　1.2.2  免疫组化染色  于黑质内注射GDNF等相应药物48 h后，将每组随机选取6只大鼠腹腔内注射戊巴比妥纳（50 mg/k g）麻醉后，经左心室升主动脉插管灌注固定，取中脑黑质节段，固定于4℃ 4%多聚甲醛中24 h。梯度脱水、透明、石蜡包埋以及连续冠状切片，片厚6 μm。切片脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波修复，5%羊血清封闭1 h（37℃）。依次按下列顺序：（1）加入一抗:CB（1∶1000）4℃过夜；（2）生物素化的二抗（1∶50）4℃过夜；（3）辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素卵白素复合物（1∶200）37℃1 h。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。最后用DAB进行显色反应。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验所选择的6OHDA注射点相当于黑质嘴侧1/3～2/3 DA能神经元的纹状体投射区，根据Paxinos和Watson（1986）图谱，选择距前囟点-4.7mm到-5.2mm之间损毁最明显区域作为阳性细胞计数区，阳性细胞在×40的物镜下进行计数。　　1.2.3  免疫印迹检测  黑质内分别注射PBS、GDNF、antiNCAM 48 h后，将每组剩余6只大鼠麻醉后断头取脑，分离右侧黑质，立即置液氮冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行，从液氮中取出黑质加4.5 ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s ×6 次), 15 000 r/min离心20 min,移取上清液(主要为胞浆部分),以牛血清白蛋白为标准测定蛋白含量,分装后立即使用或置-80 ℃冰箱待用。按Gu 等方法,等量蛋白样品经10 % SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE) 分离后,以半干转法电转移至硝酸纤维素滤膜(NC 膜)上。转移后的NC 膜经含5 % 脱脂奶粉的封闭液封闭后加入小鼠抗兔CB多克隆抗体CB(1∶1000),4 ℃过夜。用洗涤液洗膜,加入相应的二抗,37 ℃反应2 h。洗膜,以NBT/BCIP 显色,水洗终止反应, 所得膜直接用图像处理仪（Gene Company）扫描，Image J软件进行图像处理。　　1.2.4  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析。2  结果    36只大鼠均制模成功。　　2.1  各组PD模型大鼠中脑黑质CB阳性神经元数的比较  见图1、表1。组化染色结果显示，CB阳性神经元胞体大,胞质呈棕褐色,核仁清晰,突起明显。GDNF组黑质致密部CB阳性神经元数比对照组明显增多(P<0.05)；而NCAM阻断组CB阳性神经元数与GDNF组的差异无统计学意义（P>0.05）。　　图1  A、B、C分别显示对照组、GDNF组、NCAM阻断组黑质致密部CB阳性神经元分布情况（免疫组化染色×400）（略）　　表1  各组大鼠CB阳性神经元数及CB表达水平的比较（略）　　注：与对照组比较*P<0.05　　2.2  各组PD模型大鼠中脑黑质CB表达量的比较见表1。 GDNF组和NCAM阻断组CB表达量显著高于对照组(均P<0.05)。GDNF组与NCAM阻断组CB表达量相比差异无统计学意义（P>0.05）。3  讨论　　迄今为止，对GDNF 保护DA能神经元的机制，尚不明了。20世纪80年代后期，尸解发现PD患者中脑黑质致密部尚存少量具有很强抗变性能力的DA能神经元，而其共同特征是胞浆中含有CB。CB是钙结合蛋白家族中的重要成员,由于其可以结合细胞内的钙离子使细胞免受钙离子浓度过高产生的毒性作用,从而具有细胞保护作用。Meyer等［5］采用大鼠和人胚胎腹侧中脑神经细胞离体培养，经给予GDNF后发现CB阳性的DA能神经元密度增加。本实验发现，给予早期PD模型大鼠GDNF后，黑质致密部CB阳性神经元数及CB表达量明显增多，表明GDNF可通过促进CB表达而保护受损伤的DA能神经元，与Meyer等［5］的研究结果一致。　　以往观点认为仅受体酪氨酸激酶Ret能够作为GDNF的跨膜信号转导受体介导其作用。Paratcha等［6］研究证实NCAM可作为GDNF的另一种跨膜信号转导受体。NCAM属于IgG超家族，是一种广泛分布的跨膜糖蛋白，几乎在所有的神经细胞都有表达，并对神经系统的发育起重要作用。Chao等［7］研究发现在DA能神经细胞的发育期和成熟期，NCAM可调节GDNF对其的促存活和生长作用。　　本实验通过抗NCAM抗体特异性的封闭NCAM胞外段以阻断NCAM路径后，并没有阻断GDNF上调CB表达的作用。提示NCAM可能并没有参与GDNF保护DA能神经元这一路径，或对这一路径的影响微不足道。这与Chao等［7］结果不一致的原因可能为：本实验选取早期PD模型鼠，对药物的反应性可能会与正常鼠有所不同。此外，由于本实验仅观察CB这一种蛋白的表达，而未多方面的评价DA能神经元的存活情况，也可能导致未能观察到NCAM的保护作用。Paratcha等［6］发现，GDNF与NCAM结合后能够刺激海马和皮质神经元中雪旺细胞的迁移和轴突的生长，因此，NCAM也可能在其他方面，如调节突起的生长等方面介导GDNF对DA能神经元的作用。另外,GDNF也可能是通过NCAM以外的途径促进CB表达。　　本实验观察了GDNF对PD大鼠黑质CB表达的影响及可能的机制，发现GDNF可通过促进CB表达发挥对受损DA能神经元的保护作用，NCAM对GDNF上调CB表达没有影响。为进一步探讨GDNF的神经保护作用机制提供了一些实验依据。【参考文献】　　［1］Grondin R, Zhang ZM, Yi A, et al.Chronic, controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys［Ｊ］.Brain, 2002，125: 2191.　　［2］朱晓临，管绯，童萼塘，等.尼古丁对帕金森病大鼠纹状体GDNF和多巴胺含量的影响［Ｊ］.临床神经病学杂志，2002，15：139.　　［3］Yamada T, McGeer PL,Baimbridge KG,et al.Relative sparing in Parkinsons disease of substantia nigra dopamine neurons containing calbindinD28K［Ｊ］.Brain Res, 1990,526:303.　　［4］刘洪梅,王炎强,丁艳霞，等.早期帕金森病大鼠模型的建立［Ｊ］.徐州医学院学报,2005,25：481.　　［5］Meyer M, Zimmer J, Seiler RW,et al.GDNF increases the density of cells containing calbindin but not of cells containing calretinin in cultured rat and human fetal nigral tissue［Ｊ］.Cell Transplant,1999,8:25.　　［6］Paratcha G, Ledda F, Ibanez CF.The neural cell adhesion molecule NCAM is an alternative signaling receptor for GDNF family ligands［Ｊ］.Cell, 2003,113: 867.　　［7］Chao CC, Ma YL, Chu KY, et al.Integrin alphaV and NCAM mediate the effects of GDNF on DA neuron survival,outgrowth,DA turnover and motor activity in rats［Ｊ］.Neurobiol Agging, 2003,24:105.