高血糖及胰岛素干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

高血糖及胰岛素干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响作者：时进,张颖冬,林兴建,董靖德    作者单位：210029南京医科大学附属脑科医院神经内科（时进硕士研究生）    【摘要】  目的 探讨高血糖及胰岛素干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。 方法 将健康成年雄性SD大鼠160只随机分为假手术组、正常血糖组、高血糖组及胰岛素干预组,每组40只。高血糖组及胰岛素干预组采用STZ法诱导高血糖模型，以线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型，再灌注时间分别为1 h、6 h、12 h和24 h。 大鼠清醒后行神经功能缺损程度评分（NSS）、TTC染色法计算梗死体积、HE染色和原位末端标记法（TUNEL）定量观察梗死周边区域凋亡神经元数目。结果 与正常血糖组大鼠比较，再灌注同时间点高血糖组大鼠NSS显著增高（均P<0.01）、梗死体积明显扩大（均P<0.01）以及梗死周边区凋亡神经元数目明显增多（P<0.01）；与高血糖组比较，胰岛素干预可明显控制血糖、减轻神经功能损害（12 hP<0.05,24 hP<0.01）、缩小梗死体积(均P<0.01)、减少神经元凋亡数(P<0.05～0.01)，再灌注24 h甚至可达正常血糖组水平。 结论 血糖水平升高可加重缺血再灌注性脑损害，可能与其诱导神经元凋亡有关，而胰岛素可能通过阻止神经元凋亡实现神经保护作用。    【关键词】  高血糖;胰岛素;缺血再灌注;凋亡　　Effects of hyperglycemia and insulin intervention on the cerebral injury after ischemiareperfusion in rats SHI Jin, ZHANG Yingdong, LIN Xingjian, et al.Department of Neurology, Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China    Abstract：Objective  To study the effects of hyperglycemia plasma glucose and insulin intervention on the cerebral injury after ischemiareperfusion in rats.Methods  160 male SD rats were randomly divided into four groups: sham operation group, normal plasma glucose group, hyperglycemia group and insulin intervention group (40 rats in each group). The rats of hyperglycemia and insulin intervention groups were given STZ to induce hyperglycemia model. All the rats except for those in the sham operation group were subjected to right middle cerebral artery occlusion and then reperfusion. The reperfusion was started at 1 h, 6 h, 12 h and 24 h after 2 h ischemia. The neurologic functional scores, infarct volume and numbers of neuron apoptosis of the rats were analyzed with the neurological severity score (NSS), TTC staining assay and TUNEL method, respectively after the 2ats wake up.Results  Compared with normal plasma glucose group, worse neurological function score, larger infarct size and more number of apoptotic neurons were found in hyperglycemia group at the same reperfusion time (all P<0.01). Moreover, these parameters in insulin intervention group were better than those in hyperglycemia group, and even similar with those in normal glucose group after 24 h of reperfusion.Conclusions  Hyperglycemia can aggravate the cerebral injury of ischemiareperfusion, perhaps by its effect of inducing neuron apoptosis。While insulin may play neuroprotective effect by inhibiting neuron apoptosis.    Key words：hyperglycemia;insulin;ischemiareperfusion;apoptosis　　高血糖是缺血性脑卒中（IS）的危险因素之一,而且加重脑组织缺血性损伤。临床流行病学研究［1-3］已证实，控制血糖水平不仅有利于预防脑血管病发生，也作为急性脑血管病处理的重要措施。由此，本研究采用大鼠脑缺血再灌注动物模型，探讨高血糖及胰岛素干预对缺血性脑组织损伤的影响。1  材料与方法　　1.1  材料　　1.1.1  动物及分组  清洁级健康成年雄性SD大鼠160只，质量（300±20）g(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心)，随机分为假手术组、正常血糖组、高血糖组和胰岛素干预组，每组40只。制模后，根据再灌注时间随机分为缺血再灌注1 h、6 h、12 h和24 h 4个亚组，每个亚组10只。　　1.1.2  主要试剂及仪器  氯化2、3、5三氯四氮唑（TTC）购于上海生化试剂公司，用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液配制成2％的溶液，避光保存备用；细胞凋亡检测试剂盒（产品编号：MK1020）购自武汉博士德生物工程有限公司；浓缩型DAB试剂盒（产品编号：ZLI9032）购自北京中杉金桥生物试剂公司;DGG9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；佳能数码相机（日本Cannon公司）；Image J图像分析软件（北京天与地图像分析软件有限公司）；罗氏优越Ⅳ型血糖仪（美国Roche公司）。　　1.2  方法　　1.2.1  高血糖大鼠模型制作  参照链脲佐菌素（STZ）诱导法［4］,以STZ 70 mg/kg对高血糖组及胰岛素干预组大鼠单次腹腔注射。大鼠正常血糖值为4～6 mmol/L，注射后1周检测血糖≥11.1 mmol/L为成功模型选用。　　1.2.2  胰岛素干预方法  高血糖模型成功后，予胰岛素干预组大鼠普通胰岛素4 U腹壁皮下注射，每日3次，连用3 d。　　1.2.3  大鼠缺血再灌注模型制备  所有大鼠均参照改良Zea Longa方法［5］制作缺血再灌注模型。高血糖组和胰岛素干预组大鼠分别在模型成功及干预后制备该模型。以10％水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于手术操作台，取颈正中切口，游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉。于颈总动脉分叉部下方剪一小口，将一预先烧成圆头的尼龙线（30）插入颈内动脉，直到遇到轻微阻力为止，平均插入深度由分叉部计（18.5±0.5）mm。固定尼龙线，依次关闭切口。术中及术后均注意保温。假手术组不插线，其余步骤相同。缺血2 h后，拔线恢复再灌注。　　1.2.4  脑梗死体积测量  每组各时间点取5只大鼠，麻醉后迅速断头取脑，置于-20℃冰箱中冷冻10 min，距额极2 mm向后连续取冠状面均匀切成2 mm厚的脑片，置入2％TTC溶液中37℃避光孵育30 min，梗死区域组织坏死，琥珀酸脱氢酶降解，无法与TTC反应，呈现白色，而正常组织则被染成鲜红色。用Image J软件测出梗死面积。为了弥补缺血半球的脑肿胀影响，运用校正后的梗死体积替代直接测量。公式为校正梗死体积＝左半球体积（右半球体积直接测量出的梗死体积）。其中，直接测量出的梗死体积＝梗死面积之和×脑片的厚度。为消除大鼠个体差异，本研究采用梗死体积占半球体积百分值（V%）表示，V%＝梗死体积/缺血半球体积×100％。　　1.2.5  HE染色和原位末端标记法（TUNEL）免疫组化染色  每组在相应时间点各取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，立即开胸暴露心脏，经左心快速生理盐水及4%多聚甲醛灌注。断头取脑放入4%多聚甲醛固定，常规乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。连续冠状切片，片厚4 μm，常规脱蜡至水化，HE染色确定梗死区域，与HE染色相邻的切片用TUNEL免疫组化染色,观察细胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞即为凋亡的神经细胞。以40×10倍镜下计10个相邻的非重叠视野计数凋亡细胞数。　　1.2.6  神经功能缺损程度评分（NSS）［6］  在大鼠造模清醒后测评，分值>1分为模型成功，并于相应时间点处死前再评定1次。严重损伤：13～18分；中度损伤：7～12分；轻度损伤：<6分。　　1.2.7  统计学方法  各组数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 14.0统计软件行单因素方差分析，组间比较采用SNK法;P<0.05有统计学意义。2  结果　　2.1  各组血糖水平比较  见表1。各组大鼠血糖水平在缺血再灌注不同时间点变化不明显；仅高血糖组大鼠各时间点血糖水平持续性高水平，胰岛素干预组各时间点血糖水平均正常。　　2.2  各组NSS的比较  见表2。脑缺血再灌注模型各组大鼠随再灌注时间延长NSS有逐渐增加趋势。高血糖组各时间点评分均高于正常血糖组。与高血糖组相比，胰岛素干预组NSS在1 h和6 h并无显著降低，而在12 h和24 h明显降低(P<0.05～0.01)。胰岛素干预组NSS在再灌注1 h、6 h、12 h时明显高于正常血糖组(均P<0.01)，24 h与正常血糖组相似。　　2.3  各组大鼠脑梗死体积的比较  见表3。胰岛素干预组梗死体积在再灌注12 h达高峰，24 h后反有减小，与高血糖组比较，各时间点显著减小(均P<0.01)。高血糖组各时间点比正常血糖组明显增大(均P<0.01);而胰岛素干预组除再灌注24 h时间点外，比值也明显增大(均P<0.01)。　　表1  各组大鼠血糖水平的比较（略）　　注：高血糖组与其他各组比较*P<0.01　　表2  各组大鼠NSS的比较（略）　　注：与正常血糖组比较*P<0.01;与高血糖组比较△P<0.05, ▲P<0.01　　表3  各组大鼠脑梗死体积比值的比较（略）　　注：与正常血糖组比较*P<0.01；与高血糖组比较△P<0.01　　2.4  各组模型大鼠梗死灶病理改变及凋亡神经元数的比较  见图1及表4。HE染色见中心坏死区神经元数目减少，结构模糊，周边区有炎性细胞浸润，组织水肿，反光增强。与假手术组比较，正常血糖组、高血糖组和胰岛素干预组凋亡细胞数均显著增加，且随再灌注时间延长而逐渐增加。与正常血糖组比较，高血糖组各时间点、胰岛素干预组1 h和6 h时间点凋亡细胞数显著增加(均P<0.01)，再灌注12 h、24 h时点，胰岛素干预组与正常血糖组梗死周边区凋亡细胞数相似。与高血糖组相比，胰岛素干预组各时间点凋亡细胞数显著降低(P<0.05～0.01)。　　图1  模型大鼠梗死灶，中心坏死区，中心坏死区组织疏松、染色浅、细胞数目少、梗死周边区炎症细胞浸润、细胞数目较多、组织水肿、反光增强(HE染色×400倍)（略）　　表4  各组大鼠凋亡细胞数的比较（略）　　注：与假手术组比较*P<0.01；与正常血糖组比较△P<0.01；与高血糖组比较▲P<0.05，▲▲P<0.013  讨论　　血糖升高对IS的发生发展有极其重要的影响作用［7］，不但作为重要危险因素参与IS的发病过程，导致疾病发病率增高，而且对IS发生后病理过程有促进作用，加重病情，影响预后。前瞻性流行病学调查［1,2］显示：2型糖尿病患者比非糖尿病患者患脑卒中的危险性要高2～5倍；而糖尿病患者发生IS 3个月后死亡率、残疾率和功能障碍亦明显高于非糖尿病人群［3］。　　IS病灶由中心坏死区和边缘缺血半暗带组成，前者以神经元坏死为主，而后者尚有大量可存活神经元，但随病程进展，可发生神经元凋亡，致梗死区扩大［8-10］。此缺血半暗带区神经元发生凋亡与否与多种病理因素包括兴奋性毒素、氧自由基、钙超载等诱导凋亡基因表达有关。　　高血糖致脑梗死面积增大的机制较为复杂，一般认为［11］，脑缺血缺氧时葡萄糖无氧酵解加重，其终产物乳酸生成增多，而高血糖增加了底物供给，更使乳酸大量堆积，致脑组织局部酸中毒，破坏血脑屏障，加剧脑水肿及神经细胞死亡，使梗死面积扩大；同时高血糖还可引起血液高凝状态，血液流变学出现紊乱，高血糖时老化的红细胞增加，变形能力低，在血液黏稠度高的情况下易形成微小凝集物，引起毛细血管闭塞；红细胞脆性增加，较大血管梗死时供血梗死区侧支循环中血液减慢，红细胞瘀积、破碎，也参与了梗死扩大和脑水肿加剧；高血糖时脂质过氧化物明显增高，加剧了氧自由基对脑组织的损害。而且，血糖水平增高可能通过对炎性因子、氧自由基等因子调动而加重迟发性神经元死亡［12,13］，从而使脑梗死患者中长期预后变差。本实验对不同血糖水平的大鼠缺血再灌注模型的研究发现高血糖组大鼠的脑梗死体积比值、NSS及梗死周边区凋亡细胞数均明显高于正常血糖组，提示高血糖可明显加重脑梗死病情，成为致死、致残的重要因素。    对伴有高血糖的脑梗死患者，控制血糖水平，特别是采用胰岛素降低血糖已纳入急性脑卒中治疗指南［14］。胰岛素可通过纠正脑细胞内酸中毒、调节电解质平衡、清除脂质过氧化自由基等而改善脑细胞的供血供氧；且胰岛素还可通过血脑屏障进入中枢神经系统，促进蛋白质、核酸、糖原合成，促进脑细胞生长发育，对缺血脑组织有保护作用［15］。动物实验研究［15］证实胰岛素可通过降低血糖实现减小梗死面积。本研究结果证实胰岛素干预后,高血糖大鼠脑梗死体积、NSS及梗死周边区凋亡细胞数较未干预组明显改善。    本研究脑缺血模型类似于临床脑内大血管血栓性脑梗死；且动物高血糖为梗死前制备，非急性脑损伤后应激性血糖增高，所得结论有其针对性。但对临床脑梗死与血糖的关系及胰岛素干预作用的认识还需多方面实验证明。【参考文献】　　［1］Kothari V,Stevens RJ,Adler AJ,et al.UKPDS 60:risk of 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