缬沙坦对糖尿病大鼠脑组织氧化应激的影响
发表时间：2010-01-18 浏览次数：655次
缬沙坦对糖尿病大鼠脑组织氧化应激的影响作者：赵婷婷,刘雪平,陈兵,郑敏 作者单位：250021济南，山东大学山东省立医院老年神经科 (赵婷婷，刘雪平，郑敏)；山东大学第二医院肾内科(陈兵) 【摘要】 目的 探讨缬沙坦对糖尿病大鼠脑组织氧化应激的影响。方法 Wistar大鼠24只，随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病组（DM1组）、糖尿病缬沙坦治疗组(DM2组),每组8只。用链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠模型制模成功后,DM2组予以缬沙坦40 mg/(kg·d)灌胃，共12周。12周后测定各组质量、血糖，Morris水迷宫试验观察大鼠认知功能，比色法测定脑组织中羟自由基（OH-）、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,荧光实时定量反转录聚合酶链反应检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶 p47phox mRNA 表达。结果 (1)第12周未DM1组和DM2组质量明显轻于NC组(均 P<0.01)，血糖明显高于NC组( 均P<0.01);DM1组与DM2组间差异无统计学意义。(2)DM1组、DM2组逃避潜伏期较NC组明显延长(P<0.01，P<0.05), DM2组较DM1组明显缩短 (P<0.01)。(3)DM1组OH-、MDA水平显著高于DM2组和NC组（均P<0.01）,而SOD活性显著低于DM2组和NC组（均P<0.01）。（4）NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达量DM1组是NC组的4.89倍, DM2组是NC组的2.67倍,DM2组是DM1组的54.5％;各组间差异有统计学意义 (均P<0.01)。结论 缬沙坦能提高SOD的活性，降低OH-、MDA的活性和NADPH的表达，抑制机体的氧化应激水平,改善认知功能。 【关键词】 缬沙坦；糖尿病；氧化应激 Effect of Valsartan on oxidative stress in brain tissue of diabetic rats ZHAO Tingting, LIU Xueping, CHEN Bing, et al. Department 0f Geriatric Neurology, Shandong Provincial Hospital, Shandong University, Jinan 250021, China Abstract：Objective To study the effects of Valsartan on oxidative stress in brain tissue of diabetic rats.Methods Diabetic Wistar rats were induced by streptozotocin (STZ) and were randomly divided into diabetic group and Valsartan treatment group. In Valsartan treatment group, the rarts received Valsartan 40 mg/(kg·d) for 12 weeks by intragastric administration. Then blood glucose and body weight were measured. The cognition ability of rats was assayed with Morris water maze test. The activities of superoxide dismutase (SOD), maleic dialdehyde (MDA) and hydroxy radical (OH-) were detected by chromatometry. Quantitative realtime RTPCR was performed to detect the expression of NADPH oxidase p47phox mRNA.Results (1) Compared with normal control group, the body weight in diabetic group and Valsartan treatment group decreased significantly (both P<0.01), however the level of blood glucose increased significantly (both P<0.01). There was no significant difference between diabetic group and Valsartan treatment groups. (2) Morris water maze test showed that the escape latency was longer in diabetic group and Valsartan treatment group than in normal control group (P<0.01, P<0.05), and it was shorter in Valsartan treatment group as compared with diabetic group (P<0.01). (3) The levels of OH and MDA in diabetic group were much higher than those in normal control and Valsartan treatment groups (both P<0.01), while the activity of SOD decreased (both P<0.01). (4) The level of NADPH oxidase p47phox mRNA in diabetic group was 4.89 times higher than normal control group, and the level in Valsartan treatment group was 2.67 times higher than normal control group. The level in Valsartan treatment group was 54.5 percent of diabetic group (all P<0.01).Conclusions Valsartan can increase the activity of SOD and decrease the levels of OH- and MDA and the express of NADPH. So it may inhibit oxidative stress level of organism and improve cognition ability. Key words：Valsartan；diabetes；oxidative stress 糖尿病时由于代谢紊乱,自由基产生增多,并影响清除自由基的各种抗氧化酶的活性及表达,造成心脏、肾脏、血管等靶器官的损伤。本研究通过观察应用缬沙坦对糖尿病大鼠模型认知功能及脑组织中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶p47phox mRNA表达、羟自由基（OH-）和丙二醛(MDA)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，探讨缬沙坦在逆转脑组织氧化应激的作用。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物及分组 24只清洁级健康雄性Wistar大鼠，质量180～200 g（购于山东大学实验动物中心），随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病组(DM1组) 、糖尿病缬沙坦治疗组(DM2组)，每组8只。 1.1.2 主要材料 链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；Trizol试剂购于Invitrogen公司;反转录试剂盒（DDR035A）和荧光定量PCR试剂盒（DDR041S）购于大连宝生物试剂公司;引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。OH-试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒购于南京建成生物工程研究所。 1.2 方法 1.2.1 模型制备 将DM1组及DM2组大鼠禁食10 h后给予1次性腹腔内注射STZ（60 mg/kg，溶于0.1 mol／L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中pH 4.4，浓度1％），NC组仅给予等体积的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾部静脉取血检测,血糖≥16.7 mmol/L为模型建立标准。 1.2.2 缬沙坦干预方法 模型成功1 d后对DM2组大鼠给予缬沙坦40 mg/(kg·d)灌胃，共12周。NC组、DM1组予相应体积的蒸馏水灌胃。实验期间动物给予正常饮食，每2周检测1次血糖。 1.2.3 Morris水迷宫试验 Morris水迷宫为一圆形水池, 直径为100 cm，高60 cm，分为4个象限, 平台高40 cm,位于1个象限的中央,水深41 cm,放入奶粉使之成为乳白色。各组大鼠在处死前5 d开始试验,前4 d为训练,每天在4个象限各训练1次,第5 d测试,记录逃避潜伏期(从入水到找到站台所用的时间)。 1.2.4 标本采集 于缬沙坦干预后12周末，大鼠经10%的水合氯醛麻醉后，腹腔正中切开，取腹主动脉血3 ml, 2000 r/min离心10 min,取上清-20℃保存待测。剪开胸腔，行左心室生理盐水 150～200 ml持续灌洗，至右心耳流出清亮液体后，断头取脑，部分以10%多聚甲醛固定，用于石蜡切片；部分以液氮保存，用于荧光实时定量逆转录聚合酶链反应技术（RTPCR）检测及氧化应激指标的检测。 1.2.5 NADPH氧化酶 p47phox mRNA检测 取脑组织50 mg左右，应经典方法用Trizol试剂、氯仿和异丙醇进行抽提mRNA。按反转录试剂盒（DRR035A）的说明书进行，反应体系20 μl，条件为 42℃ 10～15 min 95℃ 2 min。NADPH 与β－actin引物由上海生物工程技术有限公司合成(表1)。采用ABI PRISM 7000 HT进行realtime PCR（DRR041S）,25 μl反应体系: SYBR Premix Ex TaqTM(2×Conc.) 12.5 μl、ROX Reference Dye（50×Conc.）0.5 μl、PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μl、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μl、CDNA溶液 2 μl、dH2O 9 μl。两步法PCR程序：预变性95℃ 10 s；PCR反应95℃ 5 s、 60℃ 31 s，40个循环。得出的Ct值按照公式:Folds=2(-ΔΔCt) ［1］进行各组间比较分析。 表1 NADPH和βactin引物序列（略） 1.2.6 脑组织OH-、MDA、SOD水平检测 取液氮保存的脑组织标本，采用比色法测定OH-水平，用硫代巴比妥酸法测定MDA含量, 用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,具体操作按试剂盒说明进行。以考马斯亮蓝法测定蛋白含量。 1.2.7 统计学方法 所测数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析和q检验，指标之间的相互关系采用Pearson直线相关回归分析，应用SPSS 10.0统计分析软件。2 结果 2.1 DM1组、DM2组、NC组大鼠质量、血糖的比较见表2 。第12周未，DM1组、DM2组质量明显轻于NC组(均P<0.01)，血糖明显高于NC组(均 P<0.01), DM1组与DM2组间差异无统计学意义。 2.2 各组大鼠水迷宫试验成绩的比较 见表2。DM1组、DM2组逃避潜伏期较NC组明显延长(P<0.01，P<0.05), DM2组较DM1组明显缩短 (P<0.01)。 表2 各组大鼠质量、血糖及逃避潜伏期的比较（略） 注：与NC组比较*P<0.05，**P<0.01；与DM1组比较 △P<0.01 2.3 DM1组、DM2组、NC组OH-、MDA含量及SOD活性的比较 见表3。 DM1组、DM2组OH-、MDA含量较NC组明显升高，而SOD活性则较NC组明显下降（均P<0.01）；DM2组SOD活性较DM1组明显增强，OH-、MDA含量则较DM1组明显下降（均P<0.01）。 2.4 DM1组、DM2组、NC组NADPH氧化酶 p47phox mRNA含量的比较 见表3。DM1组NADPH氧化酶 p47phox mRNA的表达量是NC组的4.89倍 (P<0.01), DM2组是NC组的2.67倍 (P<0.01)，是DM1组的54.5% (P<0.01)。 表3 各组大鼠脑组织OH-、MDA含量及SOD活性及NADPH表达的比较（略） 注：与NC组比较*P<0.01；与DM1组比较△P<0.013 讨论 糖代谢紊乱导致体内葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖化及肾素血管紧张素系统激活等因素,使体内产生大量活性氧，其初级氧代谢产物氧自由基（O- 2）和H2O2以及次级氧代谢产物,如OH-、次氯酸(HOCL) 等，它们具有细胞毒作用,过多积聚对蛋白质、脂肪和核酸均具有损害作用［2］。OH-是引起脑损伤的最主要的O- 2,可以激活磷脂酶A2,使膜磷脂分解并迅速转化为环丙脂质过氧化物,从而破坏细胞膜的完整性,导致细胞死亡［3］。NADPH 氧化酶被认为是刺激活性氧产生的最重要物质，生理条件下NADPH 氧化酶活性低,但在高糖刺激下,其活性明显上调，活化的NADPH 氧化酶以NADH/NADPH为底物将一个电子传递给氧分子形成O-2, O-2作为SOD的底物进一步被催化为H2O2, O-2和H2O2是活性氧的主要成分［4］。本研究显示DM1组较NC组NADPH 氧化酶 p47phox的表达增强，OH-含量明显升高（均P<0.01）；与DM1组比较，DM2组NADPH 氧化酶 p47phox的表达减弱，OH-含量明显下降（均P<0.01）。MDA 是脂质过氧化的降解产物,而过氧化脂质是自由基与脂质作用的产物,可间接反映自由基水平［5］。SOD是一种抗氧化酶,可清除超氧阴离子,保护组织免受超氧阴离子的损伤［6］。在高糖致大量活性氧产生的同时，抗氧化酶发生糖化或氧化,导致体内SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)等抗氧化酶活性下降,清除自由基的能力下降,MDA等反映氧化应激水平的物质含量升高［7］。本研究显示糖尿病时脑组织活性氧增多，抗氧化酶活性下降, 氧化应激反应增强，应用缬沙坦后可通过抑制NADPH 氧化酶 p47phox的表达，减少活性氧含量，抑制氧化应激。 由于神经元对活性氧的损伤作用极为敏感, 若活性氧生成过量, 氧化应激反应增强，可攻击神经元线粒体内膜上的脂类、蛋白质和线粒体DNA，使得细胞内能量衰竭和细胞死亡，引起认知功能障碍。Morris水迷宫试验显示DM1组、DM2组大鼠在训练后第5 d逃避潜伏期明显延长，表明糖尿病大鼠存在认知功能障碍；DM2组逃避潜伏期较DM1组明显缩短，说明缬沙坦对糖尿病大鼠认知功能障碍具有保护作用，其机制之一可能是抑制氧化应激。 综上所述，糖尿病时由于糖代谢紊乱等因素的影响，脑组织产生大量活性氧,并使抗氧化酶活性下降，脑组织氧化应激水平明显升高，并可能引起认知功能障碍。应用缬沙坦，通过抑制NADPH 氧化酶 p47phox的表达，降低了脑组织内活性氧的生成，提高了抗氧化酶的活性，从而改善氧化应激反应，保护认知功能，为临床糖尿病脑病的防治提供理论依据。【参考文献】 ［1］Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2［-Delta Delta C(t)］ method［J］.Methods，2001，25，402. ［2］苏彦君,李荣芬,顾连方.肾脏氧化应激与糖尿病肾病［J］. 河北医科大学学报,2001，22：186. ［3］侯丽,黄经春,朱雪涛. 羟自由基和缺血性脑血管病的研究［J］.医学综述，2005，11：426. ［4］Griendling KK,Sorescu D,UshioFukai M.NAD(P)H oxidases: role in cardiovascular biology and diease［J］. Circ Res,2000,86:494. ［5］刘姜冰，石静萍，赵薛旭,等.托吡酯对大鼠脑缺血再灌注后血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及神经功能的影响［Ｊ］.临床神经病学杂志,2006,19:203. ［6］赵连东，晋光荣，徐汉荣，等.依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑组织及血清超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛水平的影响［Ｊ］.临床神经病学杂志,2006,19:60. ［7］于冬青,邓华聪,刘金波,等. 辛伐他汀对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的抑制作用［J］,中国病理生理杂志, 2006,22:824.
