p14ARF、mdm2、p53在鼻咽癌中的表达及其临床意义

　　作者：杨治花,折虹,丁喆　　作者单位：宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川

　　【摘要】 目的 研究p14ARF、mdm2、p53在鼻咽癌组织中的表达与临床分期、淋巴结转移、预后等因素的关系。方法 应用免疫化法检测58例鼻咽癌组织和20例慢性鼻咽炎症组织中p14ARF、mdm2、p53表达情况。结果 (1)p14ARF、mdm2、p53在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎症组织中的阳性表达率分别为31.0%、41.4%、65.5%和100%、0、0，差异有统计学意义(P<0.05);(2)Spearman相关分析表明，鼻咽癌组织中p14ARF、mdm2、p53三者表达之间均无相关性;(3)p14ARF、mdm2、p53表达与鼻咽癌淋巴结转移、分期、性别、年龄无关;(4)Kaplan-Meier分析方法显示鼻咽癌组织中mdm2表达与生存时间相关(P<0.05);p14ARF、p53表达与生存时间无关。结论 p14ARF、mdm2、p53可能参与了鼻咽癌的发生;mdm2表达可作为预测鼻咽癌放疗预后的一项参考指标。

　　【关键词】 鼻咽肿瘤;p14ARF;mdm2;p53;免疫组织化学

　　The expression and clinical significance of p14ARF, mdm2, p53 protein in nasopharyngeal carcinoma　YANG Zhi-hua，ZHE Hong，DING Zhe　(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Chian) 　[Abstract] Objective To investigate the role of p14ARF, mdm2 and p53 protein in the process of carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma; analyze the relationship among the expression and clinical stage, lymph node metastasis, prognosis, et al. Methods The expression of p14ARF, mdm2 and p53 protein were detected by immunohistochemical method in 78 paraffin-embedded tissues, including nasopharyngeal carcinoma (NPC) (n=58), chronic inflammation of nasopharyngeal epithelium (CINE) (n=20). Results (1) p14ARF, mdm2, p53 positive rates in NPC, CINE were found to be 31.0%, 41.4%, 65.5% and 100%, 0, 0, respectively. The expression of p14ARF protein were significantly degraded and mdm2, p53protein were significantly elevated in NPC when compared with CINE (P<0.05). (2) Spearman correlation analysis showed that the expression of p14ARF, mdm2, p53 had no correlation in NPC (P>0.05). (3) The expression of p14ARF, mdm2 and p53 had no relationship with patients' lymph node metastasis, stage, gender, age(P>0.05). (4) Kaplan-Meier analysis showed that the expression of mdm2 was significantly correlated with survival time in NPC (P<0.05). p14ARF, p53 expression were irrelevant with the survival time(P>0.05). Conclusion p14ARF, mdm2 and p53 may be involved in the occurrence of NPC, and promote the process of normal nasopharyngeal cells to cancer. The expression of mdm2 was correlated with survival time, and can be used for predicting the prognosis of patients after radiotherapy.

　　[Key words] Nasopharyngeal neoplasm; p14ARF; mdm2; p53; Immunohistochemistry

　　鼻咽癌的发生是多基因、多途径、多阶段改变的过程，而细胞周期的调控是由许多不同基因组成的多条通路来完成的。在人类肿瘤细胞中，最主要的细胞周期调控通路有两条：RB通路(p16INK4a-CDK4/6-pRb-E2F)和p53通路 (p14ARF-mdm2-p53)，近年来p14ARF-mdm2-p53通路的作用日益受到重视。本文应用免疫组化的方法检测鼻咽癌组织中p14ARF-mdm2-p53通路各个蛋白的表达情况，并探讨各蛋白表达之间以及蛋白表达和临床因素、预后的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料:研究病例取自2000-2005年宁夏医科大学附属医院放疗科收治且完成根治性放疗的鼻咽癌患者58例。其中低分化鳞癌57例，未分化癌1例;年龄12-79岁，平均年龄49岁，≤40岁16例，>40岁42例;男性45例，女性13例;按照1992年福州分期[1]：Ⅰ期1例，Ⅱ期13例，Ⅲ期28例，Ⅳ期16例;有淋巴结转移41例，无淋巴结转移17例。选取入组患者鼻咽活检组织标本58例;另设20例慢性鼻咽炎症活检组织作为对照。以上标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm切片。

　　兔抗人p14ARF多克隆抗体购自美国Neomarkers公司，稀释度为1：250;鼠抗人mdm2单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体、即用型第二代免疫组化ElivisionTM广谱试剂盒、DAB显色剂以及其他免疫组化辅助试剂均购自福州迈新生物技术有限公司。

　　1.2 方法:免疫组织化学染色，按照说明书进行。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照为已知阳性对照片。免疫组化结果判定：在光学显微镜下每张切片随机选取5个高倍视野记数细胞(鼻咽癌组织为癌细胞;慢性鼻咽炎症组织为上皮细胞)。首先对染色强度打分：无色(0分);淡黄色(1分);棕黄色(2分);棕褐色(3分)。再对阳性细胞所占百分比打分：无阳性细胞(0分);≤10%(1分);11%-50%(2分);51%-75%(3分);>75%(4分)。染色强度×阳性细胞百分比>3分为阳性，≤3分为阴性。

　　58例鼻咽癌患者随访从确诊之日到2007年12月，随访时间11-96个月，中位随访时间24个月。

　　1.3 统计学分析:实验结果采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理，P<0.05为有统计学意义。组间比较采用χ2检验;相关性检验采用Spearman等级相关分析;应用Kaplan-Meier分析方法绘制生存曲线。

　　2 结果

　　2.1 p14ARF、mdm2、p53在鼻咽癌和慢性鼻咽炎症组织中的表达，见表1及图1-4(封2)。

　　表1 p14ARF、mdm2、p53在鼻咽癌和慢性鼻咽炎症组织中的表达(略)

　　2.2 p14ARF、mdm2、p53表达相关性分析:Spearman相关分析表明，58例鼻咽癌组织中p14ARF与mdm2、p53表达无相关性(r=0.193、0.173，P>0.05)。mdm2与p53表达亦无相关性(r=0.168，P>0.05)。

　　2.3 p14ARF、mdm2、p53表达与各临床因素之间的关系：见表2。

　　表2 p14ARF、mdm2、p53表达与各临床因素之间的关系(略)

　　2.4 p14ARF、mdm2、p53表达与预后：应用Kaplan-Meier方法绘制p14ARF、mdm2、p53不同表达的生存曲线，其中mdm2阳性组与阴性组的生存曲线呈现出明显的分离趋势(封2)，二者相比差异有统计学意义(P<0.05)。p53、p14ARF阳性组与阴性组生存曲线无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨论

　　p53 基因是目前研究最多最活跃的抑癌基因之一，鼻咽癌中存在野生型p53而很少突变，但大量研究显示鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株有p53蛋白过表达。小鼠双微粒体mdm2是一种进化上保守的癌基因，正常细胞中野生型p53和mdm2蛋白互相调节保持精细的平衡并处于低水平，有文献报道mdm2在鼻咽癌组织中的主要活化方式是过表达而不是扩增。p14ARF做为抑癌基因，其功能失活的机制主要包括基因的突变、缺失和甲基化。p14ARF功能失活则导致肿瘤的发生，研究表明多数肿瘤中p14ARF表达缺失。Kwong等[2]对33例鼻咽癌组织的研究发现p14ARF的启动子甲基化率为18%。李永强[3]等报道p14ARF蛋白在36例晚期鼻咽鳞癌中阳性表达率为44.4%。

　　本研究结果显示，鼻咽癌组织中p14ARF阳性表达明显低于慢性鼻咽炎症组织，而mdm2、p53阳性表达明显高于慢性鼻咽炎症组织，与文献报道基本一致[4]。说明鼻咽癌中p14ARF低表达、mdm2和p53高表达可能与鼻咽癌的发生有关，在鼻咽上皮恶性转化过程中起重要作用。Spearman相关分析未发现p14ARF、mdm2、p53三者表达之间的相关性，这可能与鼻咽癌发生发展过程中其它机制的共同参与有关。Hasan MK等[5]研究发现p14ARF也可不依赖mdm2而通过CARF调节p53的活性。同时也有研究认为：p14ARF除了p53依赖性通路外，还存在着非依赖于p53的通路，亦发挥重要的肿瘤抑制作用[6]。肿瘤形成是一个非常复杂的过程，G1途径各因子同时与其它相关因子相互影响形成微妙的错综复杂的网络关系，而非单纯的线性关系。

　　p14ARF、mdm2、p53和鼻咽癌各临床因素之间的相关性研究，结果报道不一。杨忠等[7]检测104例鼻咽癌患者p53阳性表达率，T3+T4组明显高于T1+T2组，但淋巴结转移及大小与p53蛋白的表达无关。程庆等[8]对59例鼻咽癌组织的研究发现颈淋巴结转移组p53阳性表达率(90.9%)明显高于无颈淋巴结转移组(57.7%)。国外亦有研究报道未发现p53和鼻咽癌临床病理因素以及预后的相关性[9]。罗均利等[10]研究发现mdm2过表达与颈淋巴结转移相关，而与T分期、年龄、性别无关。本研究结果显示，p14ARF低表达，mdm2、p53高表达与鼻咽癌患者临床分期、颈淋巴结转移无关。鼻咽癌局部浸润、颈淋巴结转移虽然早期即可发生，但也是一个多因素、多步骤过程，并非只是简单的几个基因异常改变的结果，其具体机制有待进一步探讨。

　　关于p14ARF、mdm2、p53表达与预后的文献报道较少。李锦添[11]等的研究报道显示，p53或mdm2高表达者的复发间期显著短于相应蛋白低表达/阴性者，从而得出结论：p53或mdm2蛋白高表达提示有促进鼻咽癌复发的作用，单独检测p53或mdm2蛋白在原发鼻咽癌组织的表达情况可以作为预测鼻咽癌复发倾向和临床预后的参考指标。本研究采用Kaplan-Meier方法对p14ARF、mdm2、p53和鼻咽癌预后的关系进行了统计分析，发现mdm2表达与鼻咽癌患者的生存时间显著相关，说明mdm2表达可能对鼻咽癌患者预后有影响，是一个独立预后因素，有可能成为推测鼻咽癌预后有意义的参考指标。检测mdm2在鼻咽癌中的表达状况，对其阳性表达的病例可以考虑加大治疗强度，如放疗后的巩固性化疗，从而有望改善预后，提高生存率。

　　鼻咽癌的发生发展是多因素、多途径的演变过程，多个癌基因和抑癌基因的突变失活参与其中，而p14ARF-mdm2-p53通路只是其中的一小部分，其在鼻咽癌发生发展中功能的丧失又涉及到多种机制，正确认识并理解这些机制尚需进一步的研究探讨。

　　【参考文献】

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　　[3] 李永强, 胡晓桦, 谢伟敏, 等. p14ARF、p53蛋白表达与H101治疗鼻咽癌疗效的关系[J]. 肿瘤, 2007, 27(5): 390-392.

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