慢性化脓性中耳炎的细菌学监测和药物敏感性动态分析

　　作者：熊观霞,白晶,吴旋,江广理,陈锡辉,文卫　　作者单位：中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院;耳鼻咽喉科研究所

　　【摘要】 【目的】 对慢性化脓性中耳炎脓性分泌物的细菌分布及药物敏感性进行动态检测,以了解慢性化脓性中耳炎致病菌的变化趋势和指导临床合理用药?【方法】 取近3年慢性化脓性中耳炎住院患者的鼓室内脓液行细菌培养和药物敏感试验,取得细菌分离率的排序,致病菌的药物敏感度?各类抗生素的最小抑菌浓度和相应的抑菌株数,并与本课题组在2002-2005年间同样题材的研究进行比较分析?【结果】 (1)近3年369耳中培养有微生物生长254耳,其中细菌231耳?真菌23耳,1例患耳同时检出细菌和真菌?细菌检出率依次为:凝固酶阴性葡萄球菌71耳(占30.74%),铜绿假单胞菌53耳(占22.94%),金黄葡萄球菌44耳(占19.05%),奇异变形杆菌12耳(占5.19%);(2)胆脂瘤型中耳炎以奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌感染为主,非胆脂瘤型中耳炎中以凝固酶阴性葡萄球菌感染为主?绿脓杆菌感染耳中骨质破坏相对较重?(3)铜绿假单胞菌对哌拉西林/他唑巴坦?头孢他啶?头孢吡肟?环丙沙星?庆大霉素?妥布霉素和亚胺培南敏感;奇异变形杆菌对实验药物的敏感度都很高;凝固酶阴性葡萄球菌和金黄葡萄球菌对喹努普汀/达福普汀?替考拉宁?万古霉素?莫西沙星?庆大霉素?环丙沙星都敏感?环丙沙星和莫西沙星的浓度在0.5 μg/mL时对上述四种细菌有90%以上的抑菌作用?(4)近3年与2002-2005年期间的药物敏感试验相比,4种常见致病菌的药物敏感度基本相似? 【结论】 近年来慢性中耳炎活动期患者分泌物的致病菌分布以凝固酶阴性葡萄球菌?铜绿假单胞菌?金黄色葡萄球菌?奇异变形杆菌为主;四种常见细菌在慢性化脓性中耳炎临床分型和骨质破坏中各有特点;药敏实验对临床用药有指导作用?

　　【关键词】 慢性化脓性中耳炎;细菌培养;药物敏感;最小抑菌浓度

　　Abstract: 【Objective】 To detect dynamically the bacterial distribution and drug sensitivity of the secretion of chronic supperative otitis media, and to get the message of pathogens trends and clinical medication of chronic otitis media. 【Methods】 Tympanic pus were collected and cultured from hospitalized patients in the last three years with chronic suppurative otitis media, the data of pathogenic bacteria, drug sensitivity, minimum inhibitory concentration and the number of corresponding inhibited strains were statistics and compared with the data from 2002-2005. 【Results】 (1) There were 254 strains of microbes isolated from 369 ears. 23 of them were fungi, 231 were bacteria. Coagulase-negative staphylococci (in 71 of 231 ears, 30.74%), Pseudomonas aeruginosa (in 53 of 231 ears, 22.94%), Staphylococcus aureus (in 44 of 231 ears, 19.05%), Proteus mirabilis (in 12 of 231 ears, 5.19%) were the most frequently insolated pathogens.(2)The cholesteatoma otitis media were mainly infected by Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa, and the non-cholesteatoma otitis media were mainly infected by Coagulase-negative staphylococci. The level of bone destruction might be related to pathogenic bacteria. Pseudomonas aeruginosa caused relatively severe bone destruction. (3)Pseudomonas aeruginosa were sensitivated to piperacillin/tazobactam, ceftazidime, cefepime, ciprofloxacin, gentamicin, tobramycin, and imipenem; Proteus mirabilis were sensitive to all experimental drugs; Coagulase-negative staphylococcus and Staphylococcus aureus were sensitivated to quinoline Nupu Ting/dalfopristin, teicoplanin, vancomycin, moxifloxacin, gentamicin, ciprofloxacin. Ciprofloxacin and moxifloxacin could inhibit more than 90% bacteria when their concentration were 0.5 μg/mL.(4)Compared with the drug sensitive trail of four common pathogens during 2002-2005, the result were similar. 【Conclusion】 Coagulase-negative staphylococci, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Proteus mirabilis are the main pathogenic bacteria of chronic supperative otitis media, and these four bacteria have their own characteristics in clinical classification and bone destruction of chronic supperative otitis media. Sensitivity test plays a guiding role in clinical treatment.

　　Key words: chronic supperative otitis media; bacteria culture; drug sensitivity; minimum inhibitory concentration

　　白细胞介素(interleukin 32,IL-32)是最近发现的促炎性细胞因子,由Dahl等[1]于1992年首次用丝裂原刺激活化T细胞或IL-2刺激活化NK细胞产生?其后,Kim 等[2]进一步研究发现IL-32mRNA主要表达于人体脾脏和外周血白细胞等免疫组织?细胞里,IL-32可以通过活化NF-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)途径诱导鼠巨噬细胞和人单核细胞分泌TNF-α?IL-8?MIP-2等促炎症介质,这些结果提示IL-32可能在炎症微环境中发挥重要作用?研究表明,炎症细胞?肿瘤细胞及基质细胞产生的各种细胞因子?趋化因子在肿瘤组织形成的慢性炎症微环境中发挥重要作用,常可加速肿瘤的侵袭和转移[3-4]?但是,目前关于IL-32在肿瘤中的作用并不明确,在不同肿瘤中的作用也不尽一致,最近有研究报道IL-32在胰腺癌中高表达,下调IL-32的表达能抑制肿瘤细胞的生长和促进凋亡,并能抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2?Bcl-xL 和 Mcl-1)的表达[5];相反,也有报道IL-32促进人宫颈癌细胞(Hela细胞)发生凋亡[6]?此外,有报道称IL-32亦高表达于胃癌[7]?乳腺癌及多形性胶质母细胞瘤组织[8]?目前,肺癌是全球发病率和癌性死亡率最高的恶性肿瘤之一[9],而肺腺癌是肺癌的一种常见的病理类型,常在肿瘤早期即易发生转移?本研究中,我们通过检测IL-32在60例原发性肺腺癌组织中的表达,分析其表达水平与患者各临床病理因素及预后的关系,初步探讨IL-32在肺腺癌发生发展中的作用?

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选取 2006年 1月 至 2007 年 12 月在中山大学附属第一医院呼吸内科或胸外科确诊,行活检或手术切除的原发性肺腺癌患者的石蜡标本60例,所有的患者均具有完整的存档病历及随访资料,排除有自身免疫性疾病的患者,所有患者术前均无接受抗肿瘤治疗(放疗?化疗和分子靶向治疗)?其中,男性36例,女性24例,年龄32~84岁,中位年龄58岁,按照国际肺癌研究协会(IASLC)2009年的肺癌TNM分期标准(第7版)进行分期,其中Ⅰ期30例,Ⅱ期6例,Ⅲ期14例,Ⅳ期10例?

　　1.2 研究方法

　　1.2.1〓免疫组化检测〓免疫组化的试剂分别为IL-32鼠抗人单克隆抗体(BioLgend, 美国),SP试剂盒(北京康为世纪生物公司)?免疫组化步骤参照 SP试剂盒产品说明书操作步骤依次进行,流程如下:石蜡切片厚约3 ~ 4 μm,65℃烤片1 h,常规二甲苯脱蜡?梯度酒精水化,微波炉枸橼酸盐缓冲液抗原修复 (pH 6.0),30 mL/L H2O2孵育30 min以去除内源性过氧化物酶,10 mL/L 山羊血清封闭非特异性结合位点,一抗孵育4℃过夜?室温孵育二抗1 h,PBS冲洗,DAB显色,苏木素轻度复染,最后脱水?透明?封片,显微镜下观察?

　　1.2.2 结果判断〓参照文献[10]制定本实验的染色强度的判断标准,IL-32的表达以细胞质染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞,评分方法:染色强度+染色阳性细胞百分数?染色强度评分:0,阴性;1,浅黄色;2,棕黄色;3,棕褐色?染色阳性细胞百分数评分:0,阴性;1,< 10%;2,10% ~ 33%;3,34% ~66%;4,> 66%?最后相加分数范围0 ~ 7,≥5分为高表达组(强阳性),2 ~ 4分为低表达组(阳性),<2分为不表达组(阴性)?

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 17.0软件进行统计学分析, Mann-Whitney U检验及Spearman秩相关分析IL-32表达水平与各临床病理因素的关系, Kaplan-Meier方法计算生存率, Cox 比例风险回归模型分析各临床病理因素对患者预后的影响,所有的检验均为双侧,以 P < 0.05为差异有统计学意义?

　　2 结 果

　　2.1 IL-32在肺腺癌组织中的表达

　　免疫组化结果显示,在85%(51/60)的肺腺癌组织中检测到IL-32的阳性表达,其中高表达组(强阳性)29例,低表达组(阳性)22例,不表达组(阴性)9例?在有远处转移的10例患者中均检测到IL-32阳性表达,其中有8例是强阳性?IL-32主要表达于肿瘤细胞 (图1A?B) 和浸润的白细胞 (图1 C? D),主要定位于细胞浆?此外,检测到3例支气管上皮细胞高表达IL-32 (图1 E?F), 而这3例患者均有慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 病史?

　　2.2 IL-32表达与肺腺癌患者各临床病理因素间的关系

　　IL-32的表达水平与临床分期(P = 0.004)?N分期(P = 0.006)及M分期(P = 0.039) 显著相关,而与患者的年龄?性别?吸烟史?肿瘤的大小及T分期均无显著相关性(P > 0.05,表1)?如表2所示,进一步用Spearman秩相关分析显示, IL-32表达水平与临床分期?N分期及M分期的相关系数(r)分别为0.377, 0.358 和0.283;IL-32表达水平与患者的生存时间负相关,r为-0.340?这些结果提示在临床分期晚的病例,IL-32的表达水平显著增高,IL-32高表达的患者更容易发生远处或淋巴结转移?

　　2.3 生存分析

　　作生存分析时,IL-32不表达组并入低表达组,分为高表达组(29例)和低表达组(31例)两组,Kaplan-Meier分析显示(图2),IL-32高表达组的生存率明显低于IL-32低表达组(log-rang检验,P = 0.004),IL-32低表达组5年生存率为59.2% (95%置信区间,52.1-65.6),而高表达组只有30.6%(95%置信区间,24.3-37.1)?如表3所示,单因素预后分析显示临床分期?TNM分期?肿瘤的大小及IL-32的表达水平影响患者的总生存时间(P<0.05),多因素分析提示临床分期(P=0.031)?肿瘤大小(P=0.005) 及IL-32的表达水平 (P=0.013) 是影响患者总生存时间的独立预后因素,相对危险度分别为1.441?1.319和2.928?这些结果提示患者高表达IL-32时预后差,IL-32的表达水平是影响肺腺癌患者生存的独立危险因素?

　　3 讨 论

　　近年来,越来越多的研究表明肿瘤相关的炎症微环境在肿瘤进展的过程中扮演重要角色,早在1863年德国学者Virchow就观察到肿瘤组织中存在浸润的白细胞并指出炎症与肿瘤存在关系[3]?炎症是机体对生理性或病理性因素导致组织损伤的防御反应过程,而正如Dvorak[11]所言“肿瘤是不能愈合的伤口”,因为肿瘤细胞无限制的增殖,导致部分肿瘤实质缺血缺氧,出现损伤或坏死,此时炎症细胞就会向肿瘤组织内浸润,试图清除这些组织碎片和重新修复细胞基质?此外,肿瘤细胞本身可以分泌多种细胞因子和趋化因子,还有肿瘤抗原对机体持续的刺激,在这些特定的病理状态下,必然会导致大量肿瘤相关的白细胞(如肿瘤相关的巨噬细胞?中性粒细胞?淋巴细胞和肥大细胞等)向肿瘤组织浸润,最终形成肿瘤相关的慢性炎症微环境,这些浸润的白细胞和/或肿瘤细胞可以分泌大量的促炎性细胞因子和蛋白酶等,导致肿瘤的侵袭和转移,加速肿瘤的进展[3- 4,12]?

　　IL-32是一种致炎性细胞因子,先前研究显示IL-32与一些感染性疾病?炎症性及自身免疫性疾病关系密切,IL-32显著高表达于结核分枝杆菌?甲型流感病毒及人类乳头瘤病毒的感染[13-15],亦高表达于炎症性肠病及类风湿性关节炎的患者,而且IL-32的表达水平与疾病的炎症程度及炎症介质TNF-α?IL-18和IL-1β的表达正相关[16-17],这些提示IL-32参与并促进机体的炎症过程,由此我们推测它在肿瘤相关的炎症微环境中可能也发挥一定的作用?本研究结果显示,IL-32在肺腺癌组织中的表达水平与患者的临床分期正相关,而且在有淋巴结转移和/或远处转移的患者中IL-32表达水平明显增高,在高表达IL-32的肿瘤组织里,炎症细胞的浸润更为常见,这些结果提示IL-32在肺腺癌组织中显著高表达并且与肿瘤的侵袭转移有关,而且IL-32可能有募集炎症细胞向肿瘤组织浸润的作用?而目前的问题是IL-32如何在肿瘤相关的炎症微环境发挥作用?先前有研究指出IL-32可以促进TNF-α?IL-1β?IL-6?IL-8?IL-18 和MIP-2等炎症介质的表达[2,15,18-19],而这些炎症介质与肿瘤的侵袭转移密切相关?TNF-α是肿瘤炎症微环境的重要成分之一,其高表达常导致肿瘤发生侵袭和转移,TNF-α可促进原发性胰管腺癌的生长?侵袭和转移[20],下调TNF-α的表达可以抑制肿瘤细胞的生长和播散[21]?IL-1β也在肿瘤的形成?生长和侵袭的过程中发挥重要作用?IL-1β可以通过活化NF-κB信号途径和上调uPA的表达,增强肺腺癌细胞A549的迁移能力[22],而IL-1β基因缺陷的小鼠可以减少动物模型肿瘤的转移[23]?此外,过表达的IL-6可以通过诱导肿瘤细胞产生EMT表型促进肿瘤转移[24],IL-18则可以促进VCAM-1的表达增加黑色素瘤细胞的黏附能力,与肿瘤细胞的远处转移有关[23]?肿瘤组织中IL-8的表达水平与肿瘤相关巨噬细胞浸润密度成正比,而与患者的生存时间成反比[25],IL-8同样有增强NSCLC细胞迁移的能力[26]?因此,我们推测IL-32可能通过促进上述细胞因子和/或趋化因子的表达,从而在肿瘤相关炎症微环境发挥作用,促进肿瘤的侵袭转移,而IL-32本身对肺腺癌细胞系恶性生物学行为影响的具体机制目前还不明确,本课题组正在进行深入的研究?

　　另一方面,一些炎症介质如TNF-α,IL-1β 和COX-2反过来能够促进IL-32的表达[5,14,27],这时,IL-32作为这些炎症介质的下游效应分子,促进和放大局部的炎症反应?因此,我们认为IL-32在肿瘤形成的炎症微环境中,可以和多种细胞因子或趋化因子相互作用,形成正反馈环的效应,加重肿瘤相关的炎症微环境的炎症程度,募集更多的炎症细胞向肿瘤组织浸润,从而分泌多种炎症介质或蛋白酶,促进肿瘤侵袭转移,加速肿瘤的进展过程?

　　此外,我们在3例标本中发现支气管上皮细胞明显高表达IL-32,而这3位患者均有COPD的慢性气道炎症病史,这进一步说明了IL-32与炎症密切相关?值得一提的是,研究表明COPD患者与正常人相比更容易发展为肺癌,其风险增高4.5倍[28]?而IL-32在COPD向肺癌发展的病理过程中是否发挥作用和如何发挥作用,这有待进一步研究?

　　综上所述,IL-32在有淋巴结或远处转移的患者的肺腺癌组织中的表达水平显著增高,IL-32的表达水平与患者的临床分期及预后有关,可能成为判断肺腺癌患者预后的一个有价值分子标志物?我们推测IL-32促进肺腺癌侵袭和转移的可能机制是IL-32与多种炎症介质(如TNF-α等)相互作用,促进多种细胞因子及趋化因子的表达,从而加重肿瘤局部炎症微环境改变,但确切的机制还有待进一步研究证实?

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