三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8表达的影响

三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8表达的影响作者：张鸿，马英，刘艳艳，吕永利    作者单位：110004沈阳，中国医科大学附属第二医院神经内科（张鸿， 马英）；天津市天和医院（刘艳艳）；中国医科大学解剖学教研室（吕永利）    【摘要】  目的 研究三磷酸腺苷敏感性钾通道（KATP）开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8 表达的影响。方法 200只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、对照组、KATP开放剂预处理组（开放剂组）及KATP开放剂+阻断剂预处理组（阻断剂组）。应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，应用原位末端标记法（TUNEL）、免疫组化染色、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测脑缺血再灌注后各组脑组织凋亡细胞数和caspase8 mRNA及蛋白的表达。结果 （1）缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点凋亡细胞数，开放剂组较对照组和阻断剂组显著减少（P<0.05～0.01），阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义。（2）缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点caspase8蛋白表达，开放剂组显著低于对照组和阻断剂组（P<0.05～0.01）,阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义。（3）缺血再灌注各时间点caspase8 mRNA表达，开放剂组均显著低于对照组和阻断剂组（均P<0.01）, 阻断剂组与对照组各时间点相比差异无统计学意义。结论 KATP开放剂能显著减少脑缺血再灌注后神经元凋亡和caspase8 mRNA及蛋白的表达；KATP开放剂可能通过抑制死亡受体通路发挥脑保护作用。    【关键词】  脑缺血；凋亡；三磷酸腺苷敏感性钾通道；开放剂；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8    Effect of ATP sensitive potassium channel opener on neuronal apoptosis and the expression of caspase8 in rats following cerebral ischemiareperfusion  ZHANG Hong, MA Ying, LIU Yanyan, et al.Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110004,China    Abstract：Objective  To study the effect of ATP sensitive potassium channel(KATP) opener on neuronal apoptosis and the expression of caspase8 mRNA and protein in rats following cerebral ischemiareperfusion.Methods  200 male Wistar rats were randomly divided into shamoperated group, control group, KATP opener precondition group(KATP opener group) and KATP opener and blocker precondition group(KATP blocker group). The middle cerebral artery ischemiareperfusion models were established by using the intraluminal suture occlusion method.Neuronal apoptosis were detected by TUNEL staining, the expression of caspase8 mRNA and protein were detected by immunohistochemical staining and RTPCR methods.Results  (1) The numbers of apoptotic cells in KATP opener group at 12 h, 24 h, 48 h, 72 h after cerebral ischemiareperfusion were significantly less than those in control group and KATP blocker group (P<0.05～0.01), there was no difference between control group and KATP blocker group at all times. (2) The expression of caspase8 protein in KATP opener group at 12 h, 24 h, 48 h, 72 h were significantly less than those in control group and KATP blocker group (P<0.05～0.01), there was no difference between control group and KATP blocker group at all times. (3) The expression of caspase8 mRNA in KATP opener group at all times were significantly less than those in control group and KATP blocker group (all P<0.01), there was no difference between control group and KATP blocker group at all times.Conclusions  KATP opener can significantly decrease neuronal apoptosis and the expressions of caspase8 mRNA and protein following cerebral ischemiareperfusion.KATP opener plays a neuroprotective role by inhibiting death receptor signaling pathway following cerebral ischemiareperfusion.    Key words：cerebral ischemia;apoptosis;ATP sensitive potassium channel;opener;caspase8    脑缺血后神经元死亡的形式主要包括坏死和凋亡两种，缺血中心区以神经元坏死为主，而缺血半暗带区则以神经元凋亡为主要形式［1］。目前的研究［2，3］显示凋亡受很多相关基因调控，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族（caspases）是最重要的凋亡调控基因。死亡受体通路是细胞凋亡的主要信号转导通路，以caspase8的激活为特征，并进一步启动下游的caspase瀑布样级联反应,最终诱导细胞凋亡［4］。三磷酸腺苷敏感性钾通道(KATP)开放剂是近年新发现的一种脑保护剂，其作用机制尚不完全清楚。本实验观察KATP开放剂——吡那地尔对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡和caspase8 mRNA及蛋白表达的影响，以探讨KATP开放剂对脑缺血再灌注损伤的保护作用及信号转导机制。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物及分组  健康雄性Wistar大鼠200只，质量250～300 g ,随机分为KATP开放剂预处理组（开放剂组）、KATP阻断剂+开放剂预处理组（阻断剂组）、生理盐水对照组（对照组）和假手术组。每组又分为脑缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组,每个亚组10只大鼠。    1.1.2  药物与试剂  吡那地尔和格列吡嗪（KATP阻断剂）由北京晶美生物工程有限公司提供；细胞凋亡和caspase8免疫组化检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；RTPCR 试剂盒购于大连宝生物技术有限公司。    1.2  方法    1.2.1  药物预处理  给药采用微量加样器脑室内注射方法。制模前30 min，开放剂组大鼠给予吡那地尔（2 nmol/μl）10 μl脑室内注射；阻断剂组先给予格列吡嗪(0.2 μmol/μl) 10 μl脑室内注射， 15 min后再给予吡那地尔10 μl脑室内注射；对照组给予等量生理盐水脑室内注入；假手术组大鼠不注射药物。    1.2.2  动物模型制作  大鼠大脑中动脉缺血 (MCAO) 模型制作参考改良Nagasawa线栓法［5］。将大鼠以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔内注射麻醉，仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉根部，由颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线（长50 mm，直径0.26 mm，18 mm处作标记），插入约18 mm感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线，缝合皮肤。阻断血流2 h后，拔出尼龙线实现再灌注。假手术组除不插线外，其余步骤相同。    1.2.3  凋亡细胞检测  各组在预定时间点取5只大鼠经10%水合氯醛（600 mg/kg）腹腔注射麻醉后，迅速打开胸腔，暴露心脏，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，剪开右心房，快速注入100 ml生理盐水冲洗后，4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，置4%多聚甲醛中固定2 h。常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片，切片厚度6 μm。凋亡细胞检测采用原位末端标记（TUNEL）法，操作按试剂盒说明书的步骤进行。切片染色后在高倍镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。取梗死灶边缘区域相互不重叠的4个视野，用Meta Morph(美国)图像分析系统计数凋亡细胞数。    1.2.4  Caspase8蛋白表达检测  将制好的脑组织切片用免疫组化法染色，操作步骤按试剂盒说明书进行。切片染色后在高倍镜下观察，胞浆着色呈棕黄色者为阳性细胞。取梗死灶边缘区域相互不重叠的4个视野，用Meta Morph(美国)图像分析系统测定caspase8 蛋白积分光密度值（IOD）。    1.2.5  Caspase8 mRNA检测  采用RTPCR检测。各组在预定时间点取5只大鼠麻醉后快速断头取脑，取右侧缺血侧大脑半球半暗带区皮质即距离嗅球尖端7～11 mm,矢状裂至外侧裂上1/3的皮质，液氮中保存，然后转移到-70℃冰箱统一保存进行RTPCR检测。引物序列分别为caspase8: 上游 sene: 5′ CCA  GAA  GTA CAC GCA GTC C3′( GenBank NM001033864), 下游antisene:5′CGA TAG CCC AAG GAA GTG3′ ( GenBank NM001033864),扩增产物片段长度327 bp;内参照βactin 引物序列: 上游sene:5′CAC CCT GTG CTG CTC ACC GAG GCC3′, 下游antisene:5′CCA CAC AGA TGA CTT GCG CTC AGG3′,扩增产物片段为690 bp。PCR反应体系： dd.H2O 17.1 μl,cDNA 3 μl,10× buffer 2.5 μl, dNTPs(2.5mm) 2 μl, TaqE(5 U/μl) 0.2 μl, caspase8、βactin上下游引物各0.1 μl。应用1D Kodak成像分析系统对电泳条带进行吸光度（A）值的半定量分析，结果以caspase8 mRNA产物的A值(Ac)与同一样本βactin产物的A值(Aβ)的比值（Ac/Aβ）来表示。    1.2.6  统计学方法  所有实验数据以均值±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。2  结  果    2.1  各组凋亡细胞数比较  假手术组仅见少量凋亡细胞，其他3组脑缺血再灌注模型大鼠缺血侧脑部均有较多凋亡细胞，主要分布于缺血周边区，在缺血中心区较少；凋亡细胞于脑缺血再灌注后6 h开始增多，于24 h时达到高峰，以后逐渐减少。开放剂组除脑缺血再灌注6 h外，其他各时间点凋亡细胞数明显少于阻断剂组和对照组（P<0.05～0.01）；阻断剂组与对照组各时间点凋亡细胞数差异无统计学意义（均P>0.05）。见表1、图1。    2.2  各组caspase8蛋白阳性细胞数比较  各组大鼠脑缺血再灌注不同时间脑组织caspase8蛋白阳性细胞数的分布及细胞数的变化与凋亡细胞相同。见表2、图2。    2.3  各组caspase8 mRNA表达量的比较  假手术组大鼠脑部仅有caspase8 mRNA微弱表达，开放剂组、阻断剂组和对照组脑缺血再灌注不同时间点caspase8 mRNA表达量显著高于假手术组（均P<0.01）。随脑缺血再灌注时间延长，表达量逐渐增高，于缺血再灌注24 h达高峰，以后逐渐减低。开放剂组各时间点caspase8 mRNA的表达量显著低于阻断剂组和对照组（均P<0.01），阻断剂组与对照组各时间点caspase8 mRNA表达量差异无统计学意义（均P>0.05）。见表 3。表1  各组脑缺血再灌注后不同时间凋亡细胞数的比较注：与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与阻断剂组比较△P<0.05,△△P<0.01 表2  各组脑缺血再灌注后不同时间caspase8蛋白阳性细胞数的比较 注：与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与阻断剂组比较△P<0.05,△△P<0.01表3  各组脑缺血再灌注不同时间caspase8 mRNA表达量的比较注：与假手术组比较*P<0.01;与对照组比较△P<0.01;与阻断剂组比较▲P<0.013  讨  论    1983年由Noma［6］首先发现KATP存在于豚鼠心肌细胞上，此后在胰腺β细胞、骨骼肌、平滑肌、神经元、肾上皮细胞上均发现该通道存在。KATP有2个重要的药理学特征：即能被多种钾通道开放剂激活，又能被磺酰脲类复合物抑制［7］。本实验所用吡那地尔是特异性KATP开放剂，而格列吡嗪是磺酰脲类药物，为特异性KATP阻断剂，可抵消KATP开放剂的作用。    近年发现KATP广泛分布于中枢神经系统，目前认为KATP开放剂对脑缺血损伤具有重要的保护作用。KATP开放剂能阻断脑缺血时突触前膜谷氨酸的过度释放，减少Ca2+超载，拮抗N甲基D天(门)冬氨酸（NMDA）受体介导的损伤；并通过这些作用来发挥脑保护作用［8］。但关于KATP开放剂对脑缺血后神经元凋亡是否有调节作用的报道较少。本实验结果显示给予KATP开放剂吡那地尔干预后缺血半暗带内神经元凋亡数明显减少，而同时给予KATP阻断剂格列吡嗪后就基本逆转了吡那地尔的抗凋亡作用。这说明KATP开放剂能通过减少脑缺血后神经元凋亡，发挥其脑保护作用。    细胞内有一套精细复杂的信号系统在调控着凋亡过程。死亡受体通路是脑缺血后细胞凋亡的主要信号转导通路。死亡受体作为一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因超家族，其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的区域，胞质区有一由同源的氨基酸残基构成的结构，有蛋白水解功能，称“死亡结构域”（DD）。DD使死亡信号进一步传递启动凋亡。细胞表面的死亡受体主要包括Fas/Apo1和TNFR1，通过其细胞外结构域与相应死亡配体（FasL和TNFα）结合，将细胞外凋亡信号传入细胞内，激活caspase8，最终激活下游的caspase3、6、7，启动细胞凋亡［9］。死亡受体通路以caspase8的激活为特征。本实验结果中缺血再灌注大鼠caspase8 mRNA及蛋白表达明显增高，而且其空间分布和演变过程与神经元凋亡基本一致，这说明死亡受体通路参与了脑缺血再灌注后的神经元凋亡的调控。KATP通道开放剂吡那地尔能显著减少脑缺血再灌注后caspase8 mRNA及蛋白的表达，而KATP阻断剂格列吡嗪基本抵消了吡那地尔对caspase8 mRNA及蛋白表达的影响，提示KATP开放剂可能通过对死亡受体通路产生抑制性影响，减少脑缺血再灌注后神经元凋亡。但关于KATP开放剂对脑缺血的保护作用机制尚有待进一步探讨。【参考文献】  ［1］Kametsu Y, Osuga S,Hakim AM. 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