不同龄小鼠内耳中ABAD的表达及临床意义

　　作者：汪晓锋，林昶，程金妹 作者单位：福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科， 福州 350004

　　【关键词】 ABAD;小鼠; 内耳

　　A(Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, First Affiliated Hospital of

　　Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China)

　　To investigate the variance of the ABAD expression in the inner ears of different age mice. Methods Kuming mice were divided into three groups based on the age: two weeks, five months and one year. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) was used to determine the expression of ABAD in different groups. Results The ABAD expression was statistically different in each group. With an increase of age, the expression of ABAD was increased. Conclusions ABAD may take part in the aging of inner ears, and it may have some relation to presbycusis.

　　Key words: Amyloid β binding alcohol dehydrogenase; Mouse; Inner ear

　　老年性聋的发病率逐渐上升[1]，但耳聋并不是老年人的必然表现，个体发病差异较大，可能与遗传、心血管疾病及环境噪音等有关。在小鼠的内耳螺旋神经节细胞中检测出雌激素调节酶ABAD(Amyloid β binding alcohol dehydrogenase)，但其与老年性聋有否关系还不清楚。我们研究在基因转录水平上检测ABAD在不同年龄组小鼠内耳中表达量上的动态变化，探讨它在老年性耳聋发生发展过程中的作用，为防治提供新思路。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 采用耳郭反应灵敏的健康白色红目清洁级昆明小鼠54只[上海实验动物中心，许可证号：SCXK(沪)20030003]，耳镜检查双外耳道、鼓膜正常，按年龄分别为2周龄组、5个月组、1年组3组，每组18只，雌雄各半，每3只为1小组。

　　1.2 主要试剂 RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公

　　1.4 总RNA提取cDNA合成 在无菌、低温条件下快速制备耳蜗标本，每次将3对小鼠耳蜗加入液氮研磨，并严格按照Trizol(Invitrogen 公司生产)说明书提取总RNA。按RTPCR两步法试剂盒(生物晶美)说明书进行逆转录，引物设计由Invitrogen 公司完成。

　　ABAD:5′CCCAAGCCAAGAAGTTAGGAG3′与5′TATTAGGCACCGAGGGTGAGT3′，产物大小为755?bp，以βaction作为内参照，其引物是5′ATTGTAACCAACTGGGACG3′与5′TCTCCAGGGAGGAAGAGG3′产物大小为490?bp。

　　1.5 PCR扩增 ABAD按以下反应体系进行：反应体积为25?μL，其PCR反应体系为94?℃ 5′ 94?℃ 30?s,55?℃ 30?s,72?℃ 1′,最后一个循环72?℃ 7?min总共30个循环。内参照βaction PCR的反应系统，反应体积为25?μL，其PCR反应体系为：94?℃ 2′94?℃ 60?s,55?℃ 60?s,72?℃ 1′,最后一个循环72?℃ 7?min总共30个循环。

　　1.6 PCR产物检测 将ABAD和内参照的PCR反应产物各取5?μL加入不同的含EB(溴化乙锭染色)的1%的琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TBE电泳缓冲液，电压120?V，电流60?mA,20?min。电泳结束后，用凝胶成像及分析系统成像观察电泳结果，并测定电泳条带的灰度值，以βaction为内参照，计算不同年龄组小鼠ABAD的 mRNA产物的相对量(R)。

　　1.7 对照组 阳性对照组：以小鼠的大脑组织总RNA为模板，其他条件均与实验组完全相同;阴性对照组：取相同体积的0.1%DEPC(焦碳酸二乙脂)水溶液为模板，其他条件均与实验组完全相同。

　　1.8 统计学处理 应用SPSS 11. 5软件进行统计分析，用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　ABAD mRNA的表达ABAD在不同年龄组小鼠内耳中均有表达，阳性对照组(脑组织)中ABAD也有表达，阴性对照组未见表达，见图1;以βaction为内参照，计算不同年龄组小鼠ABAD的 mRNA产物的相对表达量(R)可观察到随着年龄增大，其R值逐渐增大，见表1，说明ABAD的相对表达量逐渐增多。将2周、5个月、1年3组的R值进行两两比较，其差别均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

　　3 讨 论

　　老年性耳聋指伴随年龄老化而发生的双耳渐进性的听觉敏感度下降，以高频听力损失为主[2]。Ichimiya等[3]研究发现，随小鼠年龄增长，其内耳结构可发生一系列退行性变化，包括Corti器结构的破坏及毛细胞的减少，以及螺旋神经节细胞数量的减少及血管纹的萎缩。听力学可表现为ABR阈值增高等听力下降的表现 。近年，国内外学者研究发现雌激素对内耳及听力有一定的影响，并证实雌激素受体在内耳的存在，而雌激素受体与雌激素水平具有相关性。ABAD是调节细胞雌激素水平的重要酶类，它定位于细胞的线粒体基质上[4]，能抑制雄激素转化为雌激素，并使17β雌二醇失活，它可通过影响线粒体的呼吸链酶，参与三羧酸循环。Yang等[5]研究发现，在老年性疾病Alzheimer患者及动物模型的脑皮层及海马回中，该蛋白表达明显增加，导致细胞内17β雌二醇呈缺乏状态，减少雌激素的神经元保护作用，促进神经元的凋亡。而Tieu等[6]在研究震颤麻痹症PD(Parkinson′s disease)的患者中发现ABAD可发挥神经保护作用，在震颤麻痹症PD中ABAD能减轻由神经毒素1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine (MPTP)引起的对三羧酸循环的抑制作用及对多巴胺神经的损害作用。可见，ABAD与神经细胞的存亡关系密切。国外学者在性腺、肾上腺、膀胱及大脑等器官均可检出该蛋白。林昶等[7]以用Westronblot、免疫组织化学的方法在小鼠内耳中检测出该蛋白，证实它可定位于内耳的螺旋神经节细胞，推测ABAD可能对螺旋神经节细胞有调节作用。然而，ABAD对内耳细胞的作用究竟如何，随着年龄的变化，该蛋白在内耳中的表达变化究竟如何，目前尚未见到这方面的报道。

　　本研究发现ABAD在不同龄小鼠内耳中均有表达，统计分析的结果表明3个实验组小鼠ABAD的相对表达量差异有显著性差异(P<0.05)，测其与内参照βaction RTPCR产物电泳条带的荧光强度的比值发现，随着小鼠年龄增大，其表达量逐渐增多。这可能提示了ABAD在老年性耳聋中所起的作用与在老年性疾病Alzheimer病中所起的作用具有某种相似性，通过调节雌激素在内耳的水平来减少雌激素对内耳神经细胞的保护作用，促进内耳神经细胞的凋亡与老化，且螺旋神经节细胞的减少和变性也正是内耳退行性病理改变之一。因此我们推测ABAD与内耳细胞的退行性病变有关，可能参与了老年性聋的发生。

　　【参考文献】

　　[1] Yamasoba T, Someya S, Yamada C, et al. Role of mitochondrial dysfunction and mitochondrial DNA mutations in agerelated hearing loss[J]. Hear Res, 2006, 226:185193.

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　　[3] Ichimiya I, Suzuki M, Mogi G. Agerelated changes in the murine cochlear lateral wall[J]. Hearing Res, 2000, 139:116122.

　　[4] ElFakhri M, Middleton B. The existence of an innermembranebound, long acylchainspecific 3hydroxyacylCoA dehydrogenase in mammalian mitochondria[J].　Biochim Biophys Acta, 1982， 713:270279.

　　[5] Yang Songyu, He Xueying, Schulz H. Role of type 10 17βhydroxysteroid　dehydrogenase in the pathogenesis of Alzheimer′s disease[J]. Adv Exp Med Biol,　2001， 487：101110.

　　[6] Tieu K, Perier C, Vila M,　et al. L3HydroxyacylCoA Dehydrogenase II Protects in a Model of Parkinson′s Disease[J]. Ann Neurol, 2004, 56:5160.

　　[7] 林昶，严世都，汪晓锋，等.17β羟基类固醇脱氢酶10在小鼠内耳的表达与意义[J].中华耳科学杂志，2007,5:305306.