EphB2和EphrinB2及EphrinA1在喉癌组织中的表达及意义

　　作者：赵岩,胡俊兰,栾建兵,赵瑞力,葛俊恒,王　　作者单位：石家庄市，河北医科大学第四医院耳鼻喉头颈外科

　　河北省卫生厅科技攻关项目(编号:07315)

　　【摘要】 目的 探讨EphB2、EphrinB2和EphrinA1与喉癌发生发展的关系及探讨喉癌的发病机制。方法 应用流式细胞术检测喉癌组织、癌旁组织及喉部正常黏膜组织的EphB2和EphrinA1、EphrinB2蛋白表达的含量。基因蛋白以荧光指数(FI)>1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。结果 EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白在喉癌组织中的阳性表达率分别高于癌旁组织和正常喉黏膜组织(P<0.05或<0.01)。在喉癌组织中，EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白在淋巴结转移组的阳性表达率分别高于无淋巴结转移组(P<0.05);临床Ⅲ、Ⅳ期组的阳性表达率分别高于临床Ⅰ、Ⅱ期组(P<0.05或<0.01)。喉癌组织中EphB2蛋白与EphrinA1蛋白、EphrinB2蛋白有多元线性回归关系，且均为正相关(P<0.01)。结论 EphB2蛋白和EphrinA1、EphrinB2蛋白高表达可能与喉癌的发生、发展有关。

　　【关键词】 喉癌;EphB2;EphrinB2; EphrinA1;流式细胞术

　　The expression and significance of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 in laryngeal carcinoma tissues 　　ZHAO Yan,HU Junlan,LUAN Jianbing,et al.　　The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

　　【Abstract】Objective To investigate the relationship between the expression of EphB2, EphrinB2,EphrinA1 and the pathogenesis of laryngeal carcinoma,and to explore the mechanism of pathogenesis of laryngeal carcinoma.Methods The expression of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 protein with the flow cytometere Fluorescence index was defined as the quantitative expression index of EphB2,EphrinB2 and EphrinA1 protein. The FI value over 1.0 would be considered as positive expression, otherwise,as negative expression.Results The qualitative expressions of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 in laryngeal carcinoma tissues were obviously higher than those in paracarcinoma and in normal laryngeal mucosa tissues respectively(P<0.05 or <0.01),in laryngeal carcinoma tissues,the qualitative expressions of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 with positive metastasis were remarkably higher than those without metastasis respectively(P<0.05 or <0.01), which in clinical stage Ⅲ, Ⅳ were significantly higher than those in clinical stageⅠ,Ⅱ respectively(P<0.05 or <0.01).There was a multiple linear regression correlation in the expression of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 in laryngeal carcinoma tissues,and which was a positive correlation. Conclusion The high expression of EphB2, EphrinB2 and EphrinA1 may be related with the pathogenesis and development of laryngeal carcinoma.

　　【Key words】laryngeal carcinoma; EphB2; Ephrin B2; EphrinA1; FCM

　　Eph受体与Ephrin 配体在多种肿瘤中有表达，但尚未见到在喉癌中检测Eph受体与Ephrin配体的相关研究。本研究采用流式细胞术(FCM)检测Eph受体与Ephrin配体中的EphB2和EphrinB2、 EphrinA1在喉癌中的表达情况，并探讨EphB2和EphrinB2、 EphrinA1在喉癌发生、发展中的作用，为调控该基因表达以及深入了解喉癌的生物学行为和指导临床治疗提供可能的理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选择我科2007至2008年住院手术的喉鳞癌患者，喉癌组织40例及相应癌旁组织40例(距肿瘤切缘至少0.5 cm)，取非喉癌患者15例的喉部正常黏膜组织做对照。

　　1.2 方法

　　流式细胞术(FCM)。选用试剂：一抗：EphB2兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);EphrinB2兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);EphrinA1兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。二抗：羊抗兔FITCIgG抗体(Jackson Immuno Research 公司)。采用美国Beckerman Coulter公司生产的EpicsXLⅡ型流式细胞仪，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AN分析软件对DNA细胞周期拟合分析。结果判定：EphB2和EphrinB2、EphrinA1蛋白表达的定量分析：以荧光指数(FI)表示EphB2和EphrinB2、EphrinA1蛋白表达的相对含量。FI=实验样品的均道值/正常组织样品的均道值。均道值=LogXMode×340。阳性结果判定：FI>1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

　　1.3 统计学分析

　　应用SAS 12.6统计软件，计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率计算，并做多元线性回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 喉癌组织中的EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白阳性表达率分别高于癌旁组织和正常喉黏膜组织(P<0.05或<0.01)。见表1。表1 EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白在喉癌组织、癌旁组织和正常喉黏膜组织中的阳性表达比较例(略)注：与癌组织比较，*P<0.05，#P<0.01

　　2.2 在喉癌组织中，EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白在淋巴结转移组的阳性表达率分别高于无淋巴结转移组(P<0.05);临床Ⅲ、Ⅳ期组的阳性表达率分别高于临床Ⅰ、Ⅱ期组(P<0.05或<0.01)，见表2。表2 EphB2蛋白、EphrinB2蛋白、EphrinA1蛋白在喉癌中的表达与喉癌临床病理特征的关系例(略)注：与相关项比较，*P<0.05，#P<0.01

　　2.3 喉癌组织中EphB2蛋白，EphrinB2蛋白和EphrinA1蛋白之间均有显著的线性相关关系，且均为正相关。EphB2蛋白与EphrinB2蛋白和EphrinA1蛋白表达之间的均呈正相关(r=0.476，P<0.01;r=0.642，P<0.01)，EphrinB2蛋白与EphrinA1蛋白表达的呈正相关(r=0.718，P<0.01)。EphrinB2蛋白和EphrinA1蛋白均随着EphB2蛋白表达的增大而增大。

　　3 讨论

　　促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph 受体)是酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的分支。根据同源序列将Eph受体分为两组：EphA和EphB受体，共16种。Eph配体名为Ephrin，是Eph受体家族相互作用蛋白的缩写。根据配体结构不同分为2种亚型：EphrinA亚型，共5种;EphrinB亚型，共3种。Eph受体分布广泛，结构上高度保守，与肿瘤发生、肿瘤血管生成有关，参与神经系统细胞间相互作用，并与轴突发育路径有关。EphB2是1994年Kiyokawa等[1]从构建的胃癌组织cDNA文库中筛选出来的Eph亚类新基因。目前对EphB2 受体及其配体功能的研究方兴未艾。EphB2受体有对细胞增殖的调节作用。

　　肿瘤血管的生成对肿瘤的生长、侵袭、转移起到至关重要的作用，如果肿瘤组织的直径超过1 mm将发生广泛的血管形成。在血管的生成过程中，整合素的表达可以调节内皮细胞与基底膜、细胞外基质之间的粘附作用，酪氨酸激酶受体EphB2则可以通过RRas来控制整合素的活性[2]从而进一步调节血管的生成。细胞迁移是肿瘤侵袭和转移的重要环节。EphB2和EphrinA1均通过调节整合素活性从而影响细胞基质粘附作用，提高细胞机动性、侵袭性和转移性。

　　目前有研究发现多种恶性肿瘤EphB2和EphrinB2、EphrinA1无论在基因水平还是在蛋白水平均出现过度表达，而临近的正常组织则表现为低表达[3，4]。本研究应用流式细胞术检测喉癌组织、癌旁组织及正常喉黏膜组织EphB2和EphrinB2、EphrinA1蛋白的表达情况，结果显示EphB2和EphrinB2、EphrinA1在喉癌组织中的表达量及阳性表达率均明显高于癌旁组织及正常喉黏膜组织，但癌旁组织和正常喉黏膜组织的表达差异无统计学意义(P>0.05)。此结果证实EphB2蛋白和EphrinB2、EphrinA1蛋白可能作为致癌蛋白参与喉癌的恶性转化过程，调节喉癌细胞的增殖和分化，提示将来通过抑制该蛋白的表达可能在喉癌的临床治疗中有一定应用价值。

　　通过本研究分析发现，喉癌组织中，EphB2和EphrinB2、EphrinA1表达在有淋巴结转移组、临床Ⅲ、Ⅳ期组的表达量分别高于无淋巴结转移组、临床Ⅰ、Ⅱ期组。一些学者在其他部位的肿瘤研究发现有类似的结果[5，6]。我们可以推测EphB2和EphrinB2、 EphrinA1蛋白参与并促进了喉癌血管的生成，通过肿瘤细胞渗入血管促进喉癌浸润、转移;另外EphB2和EphrinB2、EphrinA1蛋白可能通过下调肿瘤细胞粘附性而促进喉癌的浸润和转移。因此，EphB2和 EphrinB2、EphrinA1蛋白的表达可能对判断喉癌的恶性程度、病情进展有重要价值。Eph/Ephrin系统为一复杂的信号系统，在肿瘤的发生发展中表现为：一旦肿瘤形成，即促进肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的生成、肿瘤的浸润和转移。EphB2和EphrinB2、 EphrinA1蛋白最重要的作用是参与肿瘤血管的生成，因此它们蛋白的表达主要位于肿瘤血管丰富的部位，而与临床分型、肿瘤大小无关。

　　EphB2和EphrinB2、EphrinA1在喉癌都表现为高表达，表达呈正相关(P<0.01)，即Eph B2表达愈高，Ephrin B2、 EphrinA1表达亦愈高。提示在喉癌中，Eph受体及其配体产生协同作用，共同调节肿瘤血管生成、肿瘤细胞生长、生存、侵袭及转移，有望成为喉癌的诊断标记物及生物治疗的靶点。

　　总之，喉癌细胞中高表达的EphB2和EphrinB2、 EphrinA1共同促进了喉癌的发生发展，为喉癌的诊断和治疗提供了一个新的靶点。因此深入研究EphB2和EphrinB2、 EphrinA1的生物学作用及其作用机制，进而选择最佳靶位，可能为封闭、阻断喉癌的发生、发展提供更有力的依据。

　　【参考文献】

　　1 Kiyokawa E,Takai S,Tanaka M.Overexpression of ERK,an EPH family receptor protein tyrosine kinase in various human tumors.Cancer Research,1994：36453650.

　　2 Zou JX,Wang B,Kalo MS,et al.An Eph receptor regulates integrin activity through RRas.Proc Natl Acad Sci USA，1999,96:1381313818.

　　3 Liu W,Ahmad SA,Jung YD,et al.Coexpression of ephrinBs and their receptors in colon carcinoma.J Cancer，2002,94:934939.

　　4 Hafner C,Schmitz G,Meyer S,et al.Differential gene expression of Eph receptors and ephrins in benign human tissues and cancers.Clin Chem,2004,50:490499.

　　5 杨立，朱晓玲.胃癌组织、癌前病变及正常胃黏膜组织中EphB2的表达及病理学意义.中国肿瘤临床与康复，2008,15:339342.

　　6 Meyer S,Hafner C,Guba M,et al.EphrinB2 overexpression enhances integrinmediated ECMattachment and migration of B16 melanoma cells.International Journal of Oncology,2005,27:11971206