RANKL和OPG在胆脂瘤型中耳炎中的表达及其意义

　　作者：丁寿玲 作者单位：山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科， 济南 250012

　　【摘要】 检测破骨细胞分化因子(nuclear factorkappa B ligand,RANKL)和护骨素(osteoprotegerin，OPG)在胆脂瘤型中耳炎组织中的表达水平，并探讨RANKL 和OPG在胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机制中的作用。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)法和免疫组化SP法检测RANKL和OPG在35例中耳胆脂瘤(中耳炎组)和17例正常外耳道皮肤(对照组)中的表达。结果 RTPCR检测示胆脂瘤型中耳炎组与正常对照组比较, RANKL的mRNA 表达水平升高(t=4.315;P<0.05)，OPG的mRNA表达水平无明显变化(t=0.578，P>0.05)，RANKL与OPG的mRNA比值升高，差异均有统计学意义(t=6.127;P<0.05);免疫组化SP法检测显示RANKL在胆脂瘤组织中表达增高，主要在胆脂瘤周围浸润淋巴细胞胞浆中表达，与对照组的表达比较差异有统计学意义(t=7.758，P<0.05);OPG在胆脂瘤组织中表达无明显变化，与对照组比较差异无统计学意义(t=0.623，P>0.05)。OPG/RANKL在胆脂瘤组织中较对照组明显降低(t=8.183，P<0.05)。结论 RANKL在中耳胆脂瘤周围组织中表达增高，OPG的表达降低，与骨质破坏吸收关系密切;OPG/RANKL的降低可能是中耳胆脂瘤骨质破坏的一个危险因素。

　　【关键词】 胆脂瘤 破骨细胞分化因子 护骨素

　　DING Shouling, XIA Ming, ZHANG Hanbing, ZHANG Juhong, YANG Ying, LIU Fang, XU Anting

　　(Department of Otorhinolarnygology & Head and Neck Surgery, Qilu Hospital of

　　Shandong University, Jinan 250012, China)

　　Abstract: Objective To investigate the expression of nuclear factorkappa B ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in human cholesteatoma tissues. Method Thirty cholesteatoma samples and twenty normal auditory canal skin specimens were enrolled in this study, and expressions of RANKL and OPG were determined by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry. Results The mRNA level of RANKL, but not OPG was significantly increased in the cholesteatoma group compared with the control group(t=4.315,P<0.05;t=0.578，P>0.05). Meanwhile, the ratio of OPG/RANKL was increased (t=6.127;P<0.05). Expression of the cytokine RANKL was increased in infiltrated lymphocytes in cholesteatoma tissues compared with normal external meatal skins(t=7.758，P<0.05), however, expression of OPG was not significantly changed in cholesteatoma tissues compared with normal external meatal skins(t=0.623; P>0.05). The ratio of OPG/RANKL was decreased in cholesteatoma tissues compared with normal external meatal skins(t=8.183;P<0.05). Conclusion This study reveals that the expression level of RANKL is markedly increased in the perimatrix of cholesteatoma and is closely related to bone resorption induced by cholesteatoma. The decreased OPG/ RANKL is a probable risk factor of bone resorption induced by cholesteatoma.

　　Key words: Cholesteatoma; Nuclear factorkappa B ligand; Osteoprotegerin 胆脂瘤型中耳炎属慢性炎症，其病理学特征性之一是胆脂瘤对周围骨质的破坏。既往研究中发现胆脂瘤骨质破坏过程不仅涉及多种组织固有细胞和效应细胞，而且还包括这些细胞所分泌的各种因子，其中破骨细胞的活化是胆脂瘤骨质破坏的关键[1]。最近在研究病理性骨质破坏性疾病中发现破骨细胞分化因子(nuclear factorkappa B ligand, RANKL)和护骨素(osteoprotegerin, OPG)是调节破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的关键因子。中耳胆脂瘤的骨质破坏过程与这些疾病的骨质破坏过程有许多相似之处，都与慢性炎症有密切的关系[23]。本实验拟应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法和免疫组化染色SP法检测RANKL和OPG在胆脂瘤型中耳炎组织中的表达，探讨其在胆脂瘤型中耳炎骨质破坏机制中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本 中耳炎组标本组织来自山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科住院患者35例(男19例，女11例，年龄16 62 岁)平均37.12岁,耳流脓史1个月 30年，平均5.14年;有并发症者6例，复发者2例;听骨无破坏者5例，破坏1个8例，破坏2个13例，破坏3个9例。对照组为正常外耳道皮肤组织17例，亦取自中耳术中。上述所有标本各取2块组织，1块行常规甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行5?μm连续切片用作HE染色及免疫组化染色。另1块在显微镜下仔细剔除胆脂瘤鳞屑及其他坏死组织，置于-80?℃冰箱保存, 用作RTPCR检测。所有患者术前均行颞骨高分辨CT检查，术后病理活检均证实为后天继发性胆脂瘤。

　　1.2 试剂及引物 小鼠抗人RANKL及OPG单克隆IgG抗体(Clone 70525，Clone 69146，购自R&D公司)，SP免疫组化试剂盒和DAB 显色盒(购自北京中杉生物公司)。引物序列见表1，由上海博亚生物工程公司合成。引物序列(5′3′)PCR产物(bp)GAPDH下游：GCACAGCCTGGATAGCAACG220RANKL下游：TATGAGACTTGGGATTTTGATGC557OPG下游：TGATTGGACCTGGTTACG324

　　1.3 RTPCR法检测标本中RANKL与OPG的mRNA表达 提取总RNA并行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。逆转录反应体系(20?μL) 组成成分如下：5×PCR 缓冲液4.0?μL、dNTP 2.0?μL、AMV逆转录酶 1.0?μL、OligdT 2.0?μL、RNA酶抑制剂1.0?μL、总RNA 10?μL。逆转录反应条件：42?℃逆转录反应1?h,75?℃ 10?min灭活AMV。PCR反应体系(50?μL)：RT 产物5.0?μL、10×PCR缓冲液5.0?μL、dNTP 4.0?μL、各目的基因的引物或βactin引物2.0?μL、Taq 酶1.0?μL、双蒸水29?μL。反应条件为：94?℃ 5?min 预变性,然后94?℃变性1?min，55?℃退火1?min，72?℃延伸1.5?min 共27个循环，最后72?℃延伸10?min。同时以GAPDH作内参照,行1.5%琼脂糖凝胶电泳观察,拍照。Totallab凝胶分析系统扫描照片条带A值,以目的片段(RANKL或OPG) 与内参照( GAPDH) 扩增条带的A 积分值的比值来评定RANKL和OPG mRNA 的表达水平;以RANKL和OPG各自mRNA 表达水平的比值(RANKL/OPG) 评定RANKL与OPG的相对表达水平。

　　1.4 免疫组织化学SP法检测标本中RANKL与OPG的蛋白表达 组织石蜡切片后，用防脱片载玻片捞片，置于烤箱内，60?℃ 30?min以使切片紧密黏附。石蜡切片常规脱蜡至水，用3%H2O2灭活内源性酶5 10?min。微波炉枸橼酸盐缓冲液抗原修复后，免疫组化染色方法参照SP试剂盒产品说明书操作程序依次进行，其中一抗用0.1?mol/L磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)1∶75的浓度稀释，以PBS替代一抗作阴性对照。3,3′二氨基联苯胺(DAB)显色后，苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察。

　　1.5 结果判定 RANKL和OPG均为细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)，中等阳性(棕色)，强阳性(棕褐色)。观察其在胆脂瘤组织和对照组织中表达的部位及其在细胞内的表达部位。每个组织切片中随机选取10个高倍视野，共计数1?000个细胞中的阳性细胞，取各视野阳性细胞表达的平均数作为阳性细胞表达率。

　　1.6 统计学处理 所得数据以

　　2 结 果

　　2.1 RANKL与OPG mRNA的表达结果 见图1，图2。 胆脂瘤型中耳炎组与正常对照组比较, RANKL的mRNA 表达水平升高(t=4.315;P<0.05)，OPG的mRNA 表达水平无明显变化(t=0.578，P>0.05)，RANKL与OPG的mRNA 比值升高，差异均有统计学意义(t=6.127;P<0.05),见表2。

　　2.2 RANKL,OPG的蛋白表达结果所有免疫组化切片染色背景清晰，阴性对照不着色。RANKL阳性表达定位于胞浆内，呈棕黄色，着色强度不一,部分成棕褐色。在胆脂瘤组织中，主要表达在胆脂瘤周围组织中和被破坏骨质间隙中大量浸润的淋巴细胞胞浆内，与正常对照组比较差异有统计学意义(t=7.758，P<0.05);OPG阳性表达定位于胞浆内，呈棕黄色，阳性细胞呈散在分布,着色强度不一，在胆脂瘤组织中的表达与正常对照组比较差异无统计学意义(t=0.623，P>0.05)。OPG/RANKL在胆脂瘤组织中较对照组明显降低(t=8.183，P<0.05)，结果见表3。表3 RANKL,OPG的蛋白表达水平

　　3 讨 论

　　胆脂瘤的发生和发展与中耳内的炎症有密切的关系。张全安等[4]研究表明中耳炎性病变是胆脂瘤形成主要原因。本研究结果亦显示，胆脂瘤对听骨链及周围骨质均有不同程度吸收破坏。胆脂瘤周围组织及被破坏骨质的间隙中有大量的淋巴细胞浸润，可见破骨细胞吸收骨质形成的陷窝。在正常外耳道上皮组织中仅有少量细胞内有RANKL分布，而在胆脂瘤骨吸收区周围组织中有大量淋巴细胞浸润，这些细胞在正常外耳道上皮组织中没有，其中部分淋巴细胞表达RANKL，表达强度亦增高;OPG在胆脂瘤周围组织中表达较正常外耳道上皮组织中表达略增高，主要在少量的浸润的细胞浆内，但胆脂瘤组织中OPG/RANKL比值明显低于正常外耳道上皮组织中的OPG/RANKL比值，提示中耳胆脂瘤的骨质破坏与机体免疫之间存在着密切联系。

　　Hamzei和Sudhoff等[56]在实验中发现,RANKL在胆脂瘤周围组织中的表达明显高于正常外耳道上皮组织，主要表达在活化CD4+T细胞中;同时发现在胆脂瘤周围组织中单核细胞和部分多核细胞呈现为TRAP(+)，而正常组织中则没有，提示破骨细胞前体发生了分化。Wittrant等[7]曾在牙周炎体外实验中，将活化的人B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞在MCSF存在的条件下，与破骨细胞前体共培养，三者均表达高水平的RANKL，其中CD8+T细胞还表达大量的OPG。此外，CD4+T细胞和B细胞能支持破骨细胞的分化，而CD8+T细胞抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化。因此推测在牙周炎病理性骨质破坏中B细胞、CD4+T细胞可能起破坏作用，而CD8+T细胞起保护作用。以上说明免疫系统可以通过RANKL/RANK/OPG系统，对破骨细胞活化进行复杂的反馈调控，在此过程中活化的T细胞在其中起重要的作用。

　　综上所述，RANKL和OPG参与了中耳胆脂瘤的骨质破坏过程，OPG/ RANKL之比的下降可能是中耳胆脂瘤进展的一个危险因素。动物实验已经证明OPG具有明显的抗骨吸收作用并能增加骨量。目前应用OPG治疗骨质疏松、高钙血症已进入临床试验阶段。进一步研究RANKL和OPG在中耳胆脂瘤骨质破坏机制中的作用，开发以RANKL/RANK/OPG系统为靶点的新药，将为胆脂瘤性中耳炎的防治提供新的方法。

　　【参考文献】

　　[1] Jung J Y, Chole A R. Bone resorption in chronic otitis media: The role of the osteoclast[J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec， 2002， 64(1)：95107.

　　[2] Sudhoff H, Liebehenz Y, Aschenbrenner J, et al. Expression of osteoclast stimulating and differentiating factors in a murine model of localized inflammatory bone resorption[J]. Laryngorhinootol, 2004， 83(1):149.

　　[3] 汪欣,祝威,王苹，等.中耳胆脂瘤上皮PTEN基因的表达及意义[J].听力学及言语疾病杂志,2005, 13(3)：277278.

　　[4] 张全安，张青，郑国玺，等.胆脂瘤型中耳炎形成的局部炎性浸润和刺激的病理机理研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2005，40(1)：69.

　　[5] Hamzei M, Ventriglia G, Hagnia M, et al. Osteoclast stimulating and differentiating factors in human cholesteatoma[J]. Laryngoscope, 2003, 113(3)：436442.

　　[6] Sudhoff H, Liebehenz Y, Aschenbrenner J, et al. Expression of osteoclast stimulating and differentiating factors in a murine model of localized inflammatory bone resorption[J]. Laryngorhinootol, 2004, 83(1)：1419.

　　[7] Wittrant Y, Theoleyre S, Couillaud S, et al. Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study recep tor activator of NFkB ligand and osteoprotegerin biological activities[J]. Exp Cell Res, 2004, 293(2)：292301.