实验性有机磷中毒迟发性神经病的肌肉病理特点及地塞米松、三磷酸胞苷二钠对其治疗的效果
发表时间：2010-01-04 浏览次数：628次
实验性有机磷中毒迟发性神经病的肌肉病理特点及地塞米松、三磷酸胞苷二钠对其治疗的效果作者：邢英琦，江新梅，胡轶虹，刘影，房绍宽 作者单位：吉林省科技厅资助课题(200505216) 130021长春市，吉林大学第一医院神经内科 【摘要】 目的 探讨实验性有机磷中毒迟发性神经病（OPIDN）的肌肉病理变化特点及地塞米松、三磷酸胞苷二钠（CTP）对其治疗的效果。方法 给Leghorn产卵母鸡灌甲胺磷制作OPIDN模型，在染毒后分别用地塞米松（A组）、CTP（B组）及生理盐水（C组）肌肉注射。观察各组死亡数和行为表现；分别于染毒后1周、2周、3周、4周、8周末，取鸡小腿腓肠肌光镜和电镜下观察病理变化。结果 甲胺磷染毒后A组、B组、C组死亡数分别为4、4、2只，组间的差异无统计学意义（P>0.05）。染毒后经过1周的潜伏期，出现周围神经病的症状，A组、B组、C组步态异常数分别为3、4、4只，组间的差异无统计学意义。肌肉病变主要表现为散在分布的节段性肌纤维坏死，坏死区及肌间质大量吞噬细胞浸润。A组腓肠肌坏死面积百分比在第3周、4周、8周与C组相比差异有统计学意义（均P﹤0.05），第3周Ⅰ型纤维和Ⅱ型纤维等效直径与C组比较差异有统计学意义（均P﹤0.05）。B组第3周腓肠肌坏死面积百分比及Ⅰ型纤维等效直径与C组比较差异有统计学意义（均P﹤0.05）。结论 OPIDN可导致肌肉坏死，地塞米松和CTP有减轻肌肉损害、缩短恢复时间的作用，但二者都不能阻止肌肉病变发生。 【关键词】 有机磷；迟发性神经病；肌肉病理 Pathological characteristics of muscular on delayed neuropathy induced by experimental organophosthate and the treatment efficacy of Dexamethasone and Dytidine XING Yingqi, JIANG Xinmei, HU Yihong, et al.Department of Neurology, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021,China Abstract：Objective To study the characteristics of the muscular pathological changes on the organophosthate induced delayed neuropathy(OPIDN) and the treatment efficacy of Dexamethasone and Dytidine disodium triphosphate(CTP) to it.Methods The models of OPIDN were made by infusing methamidophos into white Leghorn hens with oviposition. After poisoning, Dexamethasone(group A),CTP(group B),saline(group C) were injected into muscle respectively. The death numbers and behavior appearance were observed. At the end of 1 w, 2 w, 3 w, 4 w and 8 w after methamidophos poisoning, muscular samples of gastrocnemius were taken from the hens calf and observed under optical and electronic microscope. Results The numbers of death model were 4, 4 and 2 in groups A, B, C respectively, and there was no significant difference among those groups（P>0.05）. The symptom of peripheral neuropathy emerged 1 w after poisoning, the numbers of gait abnormal were 3, 4 and 4 respectively in groups A, B and C，and there were no significant difference among those groups. It showed that the necrosis of segments of muscle fibers and macrophages infiltration scattering distribution were observated in the necrosis area and muscular interstition. At the end of 3 w, 4 w and 8 w, there were significant differences in the area of muscular necrosis between group A and C(P<0.05). At the end of 3 w, significant difference was also found in the equivalent diameter of type Ⅰ and Ⅱ fiber(P<0.05). It showed that the necrosis of segments of muscle fibers and macrophages infiltration were scattering. At the end of 3 w, there were significant differences in the area of muscular necrosis and in the equivalent diameter of type Ⅰ fiber（between groups B and C） (all P<0.05).Conclusions OPIDN can induce muscle necrosis. The Dexamethasone and the CTP may have protective effects on muscular changes of OPIDN. However, they may not prevent OPIDN from developing. Key words：organophosphorus; delayed neuropathy; muscle pathology 有机磷中毒迟发性神经病（OPIDN）是有机磷农药中毒后的严重并发症，发生率在5%左右，多在急性中毒后1～2周、有的延迟到3～5周发病，临床表现为从肢体远端向近端发展的感觉异常和运动障碍，重者可累及锥体束，导致永久性肢体瘫痪［1］。以往OPIDN多用大剂量B族维生素、三磷酸腺苷、地巴唑、硝酸一叶秋碱及针灸等治疗，但疗效不确切。目前普遍认为糖皮质激素有助OPIDN的恢复，但不良反应多。三磷酸胞苷二钠（CTP）是核苷酸衍生物，为辅酶类药，在体内参与磷脂的合成代谢，能提高神经细胞生物膜结构的稳定性和重建能力，对心肌和脑组织有营养、再生和修复作用。该药对OPIDN是否有效，目前尚未见报道。本研究采用肌肉病理组化分析和超微结构观察，探讨OPIDN的肌肉病理变化特点及地塞米松、CTP对OPIDN的治疗效果。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物及分组 当年孵化纯种Leghorn产卵母鸡80只，购于长春市生物制品所免疫室，鸡龄1年，质量（1.5±0.5）kg；随机分为A组（染毒+地塞米松治疗，25只）、B组（染毒+ CTP治疗，25只）、C组（染毒+生理盐水，25只）及D组（不染毒，5只）。 1.1.2 主要试剂 50%甲胺磷乳油购自湖北沙隆达股份有限公司，硫酸阿托品注射液购自河南省郑州兽药厂，地塞米松磷酸钠注射液购自长春圣泰动物药业有限公司，CTP购自北京三九万东药业有限公司。 1.2 方法 1.2.1 模型制备及处理 各组鸡单只饲养于底是铁丝网眼的铁丝笼（0.5 m×0.5 m×0.8 m）中，室温21～23℃，12 h光照／12 h黑暗周期，断食24 h后用植物油溶解的甲胺磷（5 mg/ml）按2 ml/kg通过套管直接灌入鸡素囊中，在染毒前20 min （8 mg/kg）、染毒后3 h、6 h、10 h分别给予阿托品（4 mg/kg）肌肉注射1次。从染毒后第2 d起给A组地塞米松(1 mg/ kg)、B组CTP（3 mg/kg）、C组生理盐水（1 ml/kg）肌肉注射，每天1次，连续7 d;D组鸡不注射药物。 1.2.2 行为观察指标 每日观察鸡流涎、流泪、呼吸、瞳孔、肌束颤动、步态等神经病变的临床症状、体征变化，每周称重。临床OPIDN分级按照1987年Robertson［2］的标准，0级：没有体征；1级：步态异常；2级：动物用后臀休息，但还能站立；3级：完全瘫痪。 1.2.3 肌肉组织学观察 染毒后1周、2周、3周、4周、8周末各组随机取3～5只鸡用水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于实验台上，取小腿腓肠肌3 mm×1 mm×1 mm，肌肉标本分为大小两块，大块（2 mm×1 mm×1 mm）用液氮冷冻（－160℃），－20℃恒冷切片机连续切片，切片厚度为8 μm，在常温下自然干燥10～20 min后，进行常规苏木素伊红染色（HE）、改良Gomorri三色染色、还原型辅酶Ⅰ－四唑氮还原酶染色（NADHTR）、ATP酶染色；小块（1 mm×1 mm×1 mm）直接放入2.5﹪戊二醛磷酸缓冲液中固定，修块后包埋，超薄切片进行电镜观察。组化切片在LuzexF图像分析仪放大10倍后，随机选取5个视野，测定坏死部分所占视野中总面积的百分比及Ⅰ、Ⅱ型肌纤维等效直径，取其平均值。 1.2.4 统计学方法 检查结果用均值±标准差(±s)表示，组间比较用Students t检验，率的比较采用配对四格表检验。2 结 果 2.1 各组死亡率、步态异常率及质量变化的比较 见表1。鸡经甲胺磷染毒后5～10 min即表现萎靡、流涎、瞳孔缩小、喜卧。共死亡10只鸡，其中8只在染毒后2～8 d死亡，另2只分别死于染毒后12 d和40 d，A组、B组及C组死亡率差异无统计学意义（P﹥0.05）。A组、B组、C组鸡染毒后经过1周左右的潜伏期，出现周围神经病的症状和体征，表现腿无力、活动减少、喜卧、步态不稳或完全瘫痪，3组间步态异常率的比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。鸡质量变化：第1周A组、B组及C组均有不同程度减少，A组减少最明显；第2周各组质量有显著增加，A组增加的幅度最大。 表1 各组死亡率、步态异常率及质量变化比较组别只数死亡注：质量变化＝每组鸡不同时间点的平均质量－染毒前的平均质量 2.2 肌肉病理改变 鸡染毒后第1周及2周末肌肉病理学检查未见明显改变；第3周末开始可见：（1）散在分布或小群性分布轻至中度的肌纤维萎缩，其横切面呈三角形或扁平形；（2）大片状肌纤维坏死，坏死区、肌间质大量吞噬细胞浸润（图1）。肌纤维轻度 图1 C组鸡染毒后4周肌肉出现大片状肌纤维坏死，坏死区、肌间质有大量吞噬细胞浸润（HE ×10） 萎缩，Ⅰ、Ⅱ型肌纤维同样受累。与C组比较，A组Ⅰ、Ⅱ型纤维、B组Ⅰ型纤维萎缩程度轻（均P<0.05）;A组和B组腓肠肌坏死面积百分比小于C组（均P<0.05），见表2。第4周肌肉坏死更严重，吞噬细胞增多，3组间Ⅰ、Ⅱ型纤维萎缩程度差异无统计学意义（P﹥0.05）；第8周末各组肌纤维坏死面积明显缩小，浸润的吞噬细胞减少，一部分肌纤维结构已恢复正常，其中A组坏死肌纤维百分比明显低于C组（P<0.05）。 2.3 各组肌肉超微结构改变 C组鸡染毒后第1周末电镜下已见肌原纤维轻度变性，除肌原纤维明暗带模糊外，其他细胞器均正常。第3周末肌原纤维呈中度变性，肌原纤维明暗带及肌细胞境界消失，线粒体嵴模糊，线粒体空泡变性，部分肌原纤维坏死。第4周末电镜下肌原纤维坏死，肌束间线粒体和糖原消失。第8周末肌原纤维始修复，明暗带较清晰，见少量线粒体与糖原颗粒。A组、B组也出现类似改变，但病变程度轻，持续时间短。表2 3组Ⅰ、Ⅱ型纤维等效直径及腓肠肌横切面上坏死面积比较注：与C组比较*Ｐ<0.053 讨 论 有机磷农药是一种神经毒剂，无论是剧毒类还是高毒类均可引起OPIDN。中毒程度越重，发生OPIDN越多。目前已知三甲苯磷、丙胺氟磷、丙氟磷、甲胺磷、对溴磷、敌敌畏、敌百虫、稻瘟净、氧化乐果、马拉硫磷等具有迟发性神经毒性作用，发生率2%～9.1%［3］；国内甲胺磷导致迟发性神经病的报道最多。吉佑华等［4］报道238例有机磷中毒患者，其中58例急性期后出现OPIDN者均为甲胺磷中毒。 对有机磷化合物引起OPIDN的原因的研究，归结于如维生素B1缺乏、脂肪合成障碍、氟离子作用以及假性胆碱酯酶抑制等，现在认为这些观点远不能解释OPIDN的发生。目前其发病机制尚不能确定，主要有以下几种学说：（1）胆硷酯酶抑制学说；（2）神经靶酯酶老化学说；（3）免疫障碍学说；（4）钙调蛋白激酶Ⅱ在OPIDN的作用。 目前对于OPIDN并无特效的治疗措施，阿托品虽然在急性中毒对拮抗胆碱能作用有显著效果，但是并不能防止OPIDN的发生。以往许多文献报道治疗OPIDN可选用大剂量B族维生素、ATP、地巴唑、硝酸一叶秋碱治疗，但疗效不确切。elFawal等［5］根据AbouDonia的钙调蛋白激酶Ⅱ理论，把钙通道阻滞剂应用到动物实验中，认为钙通道阻滞剂能降低有机磷酸酯对钙调蛋白激酶的磷酸化作用，有效地防止OPIDN的发生，对OPIDN有一定的预防作用。但是目前还缺乏有说服力的、可靠的进一步判断钙通道阻滞剂预防OPIDN 的证据。郑荣远［6］观察到急性期加用糖皮质激素治疗的患者与不加用的患者比较，平均疗程缩短2个月，提示糖皮质激素有加速康复的作用。但Ehrich等［7］的实验表明，在有机磷染毒前后，给鸡服用低浓度去炎松，虽然可以部分地延缓或推迟由磷酸三邻甲苯酯、丙氟磷引起的迟发性神经毒性症状，但是并不防止OPIDN的发生。相反，大剂量去炎松却能加重OPIDN的症状。给动物服用脱氧皮质酮，也有类似的结果。本实验结果显示鸡经甲胺磷染毒后地塞米松治疗组与生理盐水对照组比较，第1周末、2周末临床OPIDN评分和肌肉病理改变方面未见明显差异；第3周、4周、8周肌肉坏死面积明显减小（均P<0.05），第3周Ⅰ、Ⅱ型纤维萎缩程度明显减轻（均P<0.05）。表明糖皮质激素可以减轻症状、加速恢复，但用地塞米松的动物也同样出现OPIDN，表明糖皮质激素并不能阻止OPIDN的出现。 目前多数学者认为糖皮质激素治疗有一定的作用，但其不良反应较大。虞炳庆等 ［8］ 报道用糖皮质激素治疗25例OPIDN患者，有4例出现柯兴征。因此寻找一种安全有效的治疗药物迫在眉睫。CTP是核苷酸衍生物，为辅酶类药，在体内参与磷脂的合成代谢，能够穿透血脑屏障，既是脑磷脂合成与核酸代谢的中间产物和能量来源，也能提高神经细胞生物膜结构的稳定性和重建能力，对心肌和脑组织有营养、再生和修复作用。该药物无明显不良反应，耐受性好，在临床治疗周围神经病方面取得良好的疗效。本实验结果表明，CTP组肌肉坏死面积在第3周明显小于对照组，Ⅰ型纤维萎缩程度轻于对照组，表明CTP对甲胺磷中毒后肌肉损害有一定的保护修复作用。目前国内外尚无应用CTP治疗有OPIDN肌肉损害的报道。本实验显示其虽不能阻止OPIDN的发生，但早期应用可减轻肌肉损伤程度，且不良反应小，因此临床此类患者可尝试使用。 本实验染毒后动物死亡时间主要集中在第2～8 d，1987年Senanayake等［9］首次报道急性有机磷中毒后1～4 d可发生一种以肌无力为突出表现的综合征，因发病时间居于急性胆碱能危象和OPIDN之间被称为中间综合征，为有机磷中毒的主要病死原因。本实验动物染毒后已用阿托品抢救度过急性期，死亡的主要原因可能是中间综合征所致。 本实验1周后动物出现周围神经病步态改变的发病率为16％左右，第4周时所有存活的动物步态完全恢复正常，但肌肉活检发现所有动物在第3周、4周均有明显的肌肉坏死和片状肌纤维萎缩，说明甲胺磷中毒后即使无明显的周围神经病表现，但存在肌肉损害。因此，有机磷中毒急性期过后仍需对患者进行适当的治疗及观察。【参考文献】［1］Glynn P.Neural development and neuradegeneration:two faces of neurapathy target esterase［J］.Prog Neurobiol,2000,61:61.［2］Robertson DG,Schwab BW,Silla RD.Electrophysiologic changes following treatment with organophosphorus induced delayed neuropathy producing agents in the adult hen［J］. 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