利尿钠肽和其受体在内耳的研究进展

　　作者：龙莉莉　唐玥玓　 作者单位：四川大学附属华西医院耳鼻咽喉科(成都　610041)

　　【关键词】 内耳

　　内耳是听觉、位置觉感受器官，含有内外淋巴系统，其液体容量、离子分布、局部血流调节及声音传导的机制尚未阐释清楚，推测内耳中存在的多种激素与上述机制有一定的关系。利尿钠肽(natriuretic peptides, NPs)即是其中一种激素。NPs是与液体稳态、血压等的调节有关的内源性多肽，是分子结构相似、基因来源不同的激素家族。它们与其特异的受体结合后发挥生物学作用。目前已发现三种利尿钠肽受体(NPRs)。NPs和NPRs在内耳分布广泛，它们对内耳环境的生理病理影响一直在探求中。本文就近年来的研究现状作一综述。

　　1　NPs和NPRs的简介

　　哺乳动物体内的NPs包括三型：心钠素(atrial natriuretic peptide, ANP)、B型利尿钠肽(B-type natriuretic peptide, BNP)、C型利尿钠肽(C-type natriuretic peptide, CNP)。1983年底DeBold等[1]从大鼠的心房组织中提取、分离和纯化出心钠素,日本学者随后从猪脑中分离出了BNP和CNP[2，3]。这三种NPs的长度不同，但均有由一个二硫键连接的17个氨基酸环状生物活性结构，环状结构中氨基酸的保留顺序为“半胱-苯丙-甘-X-X-X-天冬-精-异亮-X-X-X-甘-半胱-甘-半胱”，其中X代表任意一种组成人体蛋白质的氨基酸[4]。NPs在机体中的分布部位不同。人类ANP(hA NP)基因主要在心房、心室、肾脏细胞中表达，与高血压及心脏肥厚有关。人类BNP(hBNP)基因主要在心室、心房中表达，与心室的纤维化有关。人类CNP(hCNP)基因在脑、软骨细胞、暴露于细胞因子的上皮细胞中高度表达，它的缺乏与矮小症及因软骨骨化受损而致的夭折有关[4]。

　　NPs与NPRs结合后才能发挥生物学作用。目前发现NPRs有三种亚型：NPR-A/GC-A/NPR1、NPR-B/GC-B/NPR2和NPR-C/NPR3。NPR-A/GC-A/NPR1和NPR-B/GC-B/NPR2是颗粒型鸟苷酸环化酶，可催化合成cGMP;NPR-C/NPR3，也是一种膜受体，但缺乏胞内的酶活性部位，通过受体介导的内化和降解来降低NPs的局部浓度。三种NPRs对NPs的亲和力不同。NPR-A特异地结合ANP、BNP，NPR-B特异地结合CNP，NPR-C与三种NPs及其类似物的亲和力相当。NPs结合NPRs后，生理效应通过三类可与cGMP连结的蛋白产生：依赖cGMP的蛋白激酶，cGMP调节的磷酸二酯酶和环核苷酸门控的离子通道[4]。

　　NPs/NPRs系统可增加血管内皮对白蛋白等小分子的通透性，降低血容量，舒张血管平滑肌，拮抗肾素/醛固酮系统，促进水、钠排泄，降低血压;还起着神经递质/调质的作用，抑制口渴和交感活性，易化迷走神经兴奋传入[4]。内耳含内、外淋巴系统，对内耳NPs/NPRs系统的研究将对阐明其液体容量、离子分布、局部血流调节及声音传导的机制提供新的实验依据。

　　2　NPs在内耳的产生和分布

　　陈合新等用电镜研究了ANP在耳蜗细胞中的存在形式和分泌方式[5-9]：免疫电镜下可以看到在I型II型螺旋神经节细胞胞浆及轴浆中有大量直径为250 ~ 350 nm的球形颗粒，以细胞核周围较密集，这与ANP在心肌细胞中的超微定位相似;透射电镜可观察到豚鼠耳蜗血管纹ANP免疫反应(ANP-IR)阳性颗粒有两种状态，即储存颗粒和分泌颗粒。阳性颗粒有明显的限制膜，有些颗粒部分限制膜不完整，提示ANP-IR阳性颗粒分泌是以限制膜破裂而不是以胞吐的形式释放。

　　ANP在内耳分泌区域和神经区域广泛分布[10，11]。Yoon等[12]报道ANP-IR阳性颗粒存在于螺旋韧带、螺旋缘，尤其近蜗管处的成纤维细胞和纤维束旁的胞外基质;螺旋神经节、前庭神经纤维中也有，认为螺旋韧带、螺旋缘与内外淋巴相接，外淋巴可能通过血管纹，由富含ANP-IR阳性产物的螺旋韧带与螺旋缘进入中阶，形成内淋巴。他们没有在血管纹中观察到ANP-IR阳性颗粒的存在。与此不同，陈合新等在血管纹中发现了ANP-IR阳性产物，以血管纹的边缘细胞及中间细胞中为多，基底细胞和血管上皮细胞胞浆内含量较少，提示血管纹可能具有分泌ANP的功能[6]。迄今尚未发现内耳中BNP mRNA的存在[13]。

　　在鼠内耳有CNP mRNA的转录[14，15]。 CNP-IR阳性颗粒分布在鼠内耳螺旋韧带邻近血管纹的纤维细胞和血管纹的基底细胞、前庭暗细胞、暗细胞下的纤维细胞和内淋巴囊细胞，尤其是其中部富线粒体细胞(mrc)等分泌区域，提示CNP在鼠内耳的分泌部位产生，并被分泌进入内淋巴液，以自/旁分泌形式发挥作用;螺旋神经元胞体的胞浆内、前庭神经元中也含CNP-IR阳性颗粒，提示CNP可能也影响内耳传入神经的活动[16]。

　　3　NPRs在内耳的分布

　　对NPRs在内耳的分布也作了大量研究，但NPRs分布部位尚存在许多有争议的地方。

　　3.1　NPRs在内耳分泌部位的研究

　　3.1.1　大量研究证实耳蜗外侧壁分布着NPRs。用放射自显影术在血管纹中发现了ANP受体[11];经ANP刺激后cGMP含量的增加，也间接提示血管纹中guanylyl cyclases(GC-A)的存在[17]; RT-PCR法测到鼠血管纹中有GC-A mRNA的转录[18]。NPR-C在血管纹中是否存在有待进一步研究。　螺旋韧带中也有ANP受体[19， 20]，有GC-A、GC-B的mRNA　转录[21，22]。

　　3.1.2　关于壶腹和椭圆囊暗细胞区(分泌区域)的ANP受体分布情况，研究结果不一。有学者报道其上有ANP受　体[11，19，20];测出暗细胞区GC-A mRNA与GC-B mRNA比例为1：5[18]。Koch等[17]则未发现前庭存在ANP受体。

　　3.1.3　用放射自显影术未观察到豚鼠内淋巴囊含ANP受　体[11];用免疫组化法则发现人内淋巴囊区域NPR-B有中至强度阳性染色，NPR-C有弱至中度阳性染色，尤其在皱褶区，未发现NPR-A[23];三种受体基因在内淋巴囊均有转　录[18， 24， 25]，但原位免疫杂交未发现其存在[24]，说明内淋巴囊中NPRs基因的转录量甚微，其表达的蛋白质或作用次要，或结构稳定。

　　3.2　NPRs在内耳神经部位的分布

　　GC-A mRNA在螺旋神经节少突胶质细胞中转录[21]。GC-B mRNA在初生乳鼠分布于整个耳蜗;在8天龄幼鼠，螺旋神经节和其周围表达更强;在成年鼠，GC-B mRNA仅出现在螺旋韧带和螺旋神经节[22]。原位杂交分辨率未高到能辨别GC-B mRNA是在神经节中的神经细胞还是非神经细胞，故不可推知其所表达的蛋白质是发挥神经调质/递质的功能，还是用于维持液体、离子平衡。此外，在Corti器、前庭膜、前庭感觉细胞中也有GC-A、GC-B mRNA的转录[18]。

　　4 NPs/NPRs系统在内耳细胞中的信号传导及调节

　　NPs/NPRs系统在内耳细胞中的信号传导与在其它组织中的有些差别。在体外状态下，ANP刺激鼠耳蜗血管纹细胞产生的cGMP的量不因腺苷酸环化酶的参与而增多或减少，也不因加入G蛋白的强抑制剂而减少，提示耳蜗中的ANP受体不与腺苷酸环化酶耦连，也不与G蛋白耦连，有别于心肌细胞[17]。Dornhoffer等[23，25] 研究了NPs/NPRs系统在内耳的调节。他们将ANP注入鼠内耳圆窗，测到三种NP受体在内耳中的转录量上升;将ANP与抗ANP抗体混合注入，则引起受体上调受抑，提示外淋巴液激素对内淋巴液激素受体有调控作用。关于外淋巴液激素浓度的改变是如何影响到内淋巴液激素受体的，其机制尚待阐明。

　　5 内耳NPs/NPRs系统的生理、病理意义

　　5.1　对内淋巴Na+浓度的影响：内淋巴中Na+ 浓度为 ～ 2 mmol/l，外淋巴中 Na+ 浓度为 ～ 150 mmol/l。ANP-IR阳性产物在血管纹近游离缘处多，基底部少，提示ANP可能与其直接感受内淋巴液中的离子信息有关。当内淋巴中Na+ 浓度增高时，可使血管缘边缘细胞内ANP迅速释放至内淋巴中，与受体结合，调节内耳离子和水的平衡[6]。内淋巴钾离子高浓度状态及稳定的耳蜗内电位,对于维持正常听觉至关重要。在离子转运过程中，Na+- K+-ANP酶发挥重要作用。Na+- K+-ANP酶主要分布在内耳分泌区域细胞的底侧壁皱褶区，与NPs、NPRs在内耳的分布部位不同，推测NPs/NPRs系统对K+浓度的影响不大[26-28]。

　　5.2　对内淋巴液体压力的影响：徐志勇等[29]通过外耳道间断加压研究淋巴液压力改变对豚鼠膜迷路积水和ANP表达的影响，发现加压的耳血管纹和螺旋韧带中ANP表达减弱，提示耳蜗外侧壁的ANP阳性细胞有自分泌或旁分泌功能，其分泌方式可能与心房肌细胞相似：内外淋巴压力提高使阳性细胞内ANP移向细胞外，结合存在于内耳中的ANP受体，调节淋巴液体平衡。ANP也可能通过神经通路调节内耳液体压力。Bartoli等[30]报道内耳结构的压力变化可通过神经通路影响抗利尿激素的释放。ANP-IR阳性产物在螺旋神经元、前庭神经纤维、网状核、孤束核、蓝斑中均被 发现，提示ANP在调节和维持内耳液体平衡的机制中有重 要作用。

　　ANP也可能以循环分泌方式与内耳的液体稳态存在联系[31]。内耳是由终末动脉供血的器官，其特有的液体系统使其比其它器官更易受循环系统状态的影响。ANP可在降低血压的同时，增加血管内皮细胞的通透性，增加组织间的水肿。在因感音神经性突聋而受治的患者中同时也发现了低血压;在特发性低血压患者中出现轻微的失聪是常见的。低血压与耳聋的关系提示了ANP作为循环激素对内淋巴液体平衡的影响。血液循环中的NPs能否通过血迷路屏障进入内耳淋巴尚未见报道，NPs与其受体在内耳的分布部位尚有争议，故耳蜗中的NPs调节内耳液体平衡的分泌机制类型有待进一步研究。

　　5.3　对内耳血流的影响：Rachel等[32]在豚鼠静脉内注入ANP，以观察它对内耳血流的影响，发现低浓度的ANP可减少前庭血流，高浓度的ANP却增加前庭血流，提示ANP对前庭血流有调节作用。熊巍等发现豚鼠耳蜗缺血再灌注后即刻应用ANP，可以减轻耳蜗的缺血再灌注损伤，在增加耳蜗血流的同时，降低听反应阈，提示ANP与内耳血流的局部调节有关[33]。林颖等的实验结果表明[34]，豚鼠静脉内使用低浓度的ANP溶液引起耳蜗血流量升高并维持较长时间;中等浓度的ANP溶液引起耳蜗血流量的迅速升高继而迅速下降;高浓度的ANP溶液引起耳蜗血流量相对平稳的升高和下降。研究发现蜗轴螺旋动脉主干及底转分支的血管壁均有ANP-IR阳性产物;在2 ~ 4转的分支为阴性。推测在神经系统的参与下，ANP自细胞释放后主要作用前述部位的血管内皮细胞，舒张血管，并对耳蜗血流量进行调节。这符合既往在ANP舒血管作用研究中发现的特点：ANP对大血管作用强，对小血管的作用差。其原因可能与ANP受体分布差异相关[35]。该研究还发现血管纹细胞呈ANP免疫组化强阳性染色，螺旋韧带则呈弱阳性。这些部位丰富的毛细末梢血管缺乏神经的支配，血流量受代谢产物自主控制，推测ANP介导了这一控制作用[35]。爆震后豚鼠耳蜗血管纹ANP-IR阳性颗粒增多，也提示创伤致内耳代谢产物增多，引起代偿性ANP调节耳蜗毛细末梢血管血流量，改善组织代谢[36]。机体血液循环中的NPs和耳蜗微循环中的NPs浓度是否一致未见报道。静脉使用ANP可影响内耳血流及血管纹细胞ANP免疫组化强阳性提示ANP可以循环分泌或旁/自分泌的方式影响内耳血流。ANP与分布在血管内皮细胞表面的受体结合，激活受体胞内段的鸟苷酸环化酶活性，催化生成第二信使环鸟苷酸，激活依赖环鸟苷酸的蛋白激酶G，使靶蛋白的丝/苏氨酸残基磷酸化，抑制外源性Ca2+ 内流和肌浆网Ca2+ 释放，细胞内Ca2+ 浓度下降，血管扩张，内耳血流得以调节。

　　5.4　在内耳神经组织中的作用：在耳蜗毛细胞中发现有ANP-IR阳性产物，提示ANP是声信号的传递过程中的递质/调质;在1 - 4回螺旋神经节细胞均有ANP-IR阳性产物，提示ANP肽能神经在声信号传递过程中，接受较广的音频范围[5]。

　　CNP在内耳的作用已在前文叙述。

　　6　结语及展望

　　NPs/NPRs系统分布在内耳分泌部位、神经部位，在内耳淋巴液的生成、耳蜗血流量的调节及声信号的传导等方面担负着重要作用。但NPRs的亚型在具体细胞中的分布、数量，以及对上述方面的调控机制有待进一步研究。前述免疫组化技术多未能分辨NPRs的亚型。RT-PCR术是高度灵敏的，其转录的mRNA即使含量微少，也可被测出，但不能确定转录产物是否会翻译为数量足够的蛋白质。原位杂交组织化学技术属于固相核酸分子杂交的范畴，能证明核酸分子在细胞或组织中存在的部位，但仍不能反映核酸所表达的蛋白质情况，这一技术在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。受体单克隆抗体免疫组化术的应用可避免上述三种实验方法的局限，有望确定内耳中NPRs的亚型[37]。

　　【参考文献】

　　1　Baines AD, DeBold AJ, Sonnenberg H. Natriuretic effect of atrial extract on isolated perfused rat kidney. Can J Physiol Pharmacol, 1983, 61(12): 1462-1466.

　　2　Sudoh T, Kangawa K, Minamino N, et al. A new natriuretic peptide in porcine brain. Nature, 1988, 332(6159): 78-81.

　　3　Sudoh T, Minamino N, Kangawa K, et al. C-type natriuretic peptide(CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168(2): 863 -870.

　　4　Potter LR, Abbey-Hosch S, Dickey DM. Natriuretic peptides, their receptors, and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions. Endocr Rev, 2006， 27(1): 47-72.

　　5 陈合新，邱建华. 心钠素在豚鼠耳蜗螺旋神经节中的分布及定位. 中华医学杂志, 1996， 76(2)：147-148.

　　6　陈合新，邱建华，乔莉，等. 豚鼠血管纹心钠素(ANP)免疫组化分布及超微定位. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1993， 28(6): 339-341.

　　7 Chen HX, Wang JL, Liu QC, et al. Distribution and location of immunoreactive atrial natriuretic peptides in cochlear stria vascularis of guinea pig. Chin Med J, 1994, 107(1): 53-56.

　　8　陈合新, 邱建华, 乔莉，等. 心钠素在豚鼠耳蜗蜗管外壁的分布. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1997, 11(7): 294-295.

　　9　陈合新, 王锦玲. 豚鼠耳蜗心钠素免疫反应阳性颗粒的超微结构观察. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1998, 12(9): 415-417.

　　10　Meyer-zum-Gottesberge AM, Gagelmann M, Forssmann WG.. Atrial natriuretic peptide-like immunoreactive cells in the guinea pig inner ear. Hear Res, 1991, 56(1-2): 86-92.

　　11　Meyer-zum-Gottesberge A, Schleicher A, Drummer C, et al. The volume protective natriuretic peptide system in the inner ear. Comparison between vestibular and cochlear compartments. Acta Otolaryngol Suppl, 1995， 520(pt 1): 170-173.

　　12　Yoon YJ, Hellstrom S. Immunohistochemical localization of alpha-atrial natriuretic polypeptide in the rat cochlea. Acta Otolaryngol, 1992, 112(4): 604-610.

　　13　Suzuki M, Kitano H, Kitanishi T,et al. RT-PCR analysis of mRNA expression of natriuretic peptide family and their receptors in rat inner ear. Brain Res Mol Brain Res, 1998， 55(1): 165-168.

　　14　Suzuki M, Kitano H, Kitanishi T, et al. Detection of C-type natriuretic peptide (CNP) and atrial natriuretic peptide (ANP-B) receptor mRNAs in rat inner ear.　Neuroreport，1997， 8(2): 439-443.

　　15　Suzuki M, Kitano H, Kitanishi T, et al. RT-PCR analysis of mRNA expression of natriuretic peptide family and their receptors in rat inner ear. Brain Res Mol Brain Res, 1998， 55(1): 165-168.

　　16　Suzuki M, Kitanishi T, Kitano H, et al. C-type natriuretic peptide-like immunoreactivity in the rat inner ear. Hear Res, 2000，139(1-2): 51-58.

　　17 Koch T, Gloddek B, Gutzke S. Binding sites of atrial natriuretic peptide (ANP) in the mammalian cochlea and stimulation of cyclic GMP synthesis. Hear Res, 1992，63(1-2): 197-202.

　　18 Seebacher T， Beitz E， Kumagami H，et al. Expression of membrane-bound and cytosolic guanylyl cyclases in the rat inner ear. Hear Res, 1999，127(1-2)：95-102.

　　19　Lamprecht J, Meyer zum, Gottesberge AM. The presence and localization of receptors for atrial natriuretic peptide in the inner ear of the guinea pig. Arch Otorhinolaryngol，1988， 245(5): 300-301.

　　20　Meyer-zum-Gottesberge A, Lamprecht J. Localization of the atrial natriuretic peptide binding sites in the inner ear tissue-possibly an additional regulating system. Acta Otolaryngol Suppl, 1989， 468: 53-57.

　　21 Furuta H, Mori N, Luo L,et al. Detection of mRNA encoding guanylate cyclase A/atrial natriuretic peptide receptor in the rat cochlea by competitive polymerase chain reaction and in situ hybridization. Hear Res, 1995， 92(1-2): 78-84.

　　22 Furuta H, Luo L, Ryan AF,et al. Expression of mRNA encoding asopressin V1a, vasopressin V2, and ANP-B receptors in the rat cochlea. Hear Res, 1998，117(1-2): 140-148.

　　23 Dornhoffer JL, Danner C, Li S. Natriuretic peptide receptors in the human endolymphatic sac. Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2002，128(4): 379-383.

　　24 Furuta H, Sato C, Kawaguchi Y, et al. Expression of mRNAs encoding hormone receptors in the endolymphatic sac of the rat. Acta Otolaryngol，1999，119(1): 53-57.

　　25 Boone RT, Zuo C, Fan CY, et al. Modification of atrial natriuretic peptide receptor expression in the rat inner ear. Otol Neurotol， 2005， 26(3): 534-537.

　　26 Pitovski DZ， Kerr TP. Sodium- and potassium-activated ATPase in the mammalian vestibular system. Hear Res， 2002， 171(1-2): 51-65.

　　27 Hossler FE，Avila FC，Musil G. Na+, K+-ATPase activity and ultrastructural localization in the tegmentum vasculosum in the cochlea of the duckling. Hear Res， 2002， 164(1-2): 147-154.

　　28 钟时勋， 牟忠林， 刘兆华， 等.豚鼠内淋巴囊Na- K-ATP酶亚基异构体的表达. 中华耳鼻咽喉科杂志， 2001， 36(2): 109-111.

　　29 徐志勇，刘兆华. 外耳道间断加压对豚鼠膜迷路积水及ANP表达的影响. 第三军医大学学报， 2001， 23(10)： 1180-1182.

　　30 Bartoli E， Satta A， Melis F， et al. Volume receptors in guinea pig labyrinth：Relevance with respect to ADH and Na control. Am J Physiol， 1989， 257(3 Pt 2)： F341-346.

　　31 Borghi C, Modugno GC, Brandolini C,et al. Is there a role for atrial peptides in the labyrinthine "disease"? Medical Hypotheses，2006，66(6): 1188-1190.

　　32 Rachel JD, Dziadziola JK, Quirk WS. Atrial natriuretic peptide participates in the regulation of vestibular blood flow. Hear Res， 1995， 89(1-2): 181-186.

　　33 熊巍， 邱建华， 林颖，等. 心钠素对耳蜗缺血再灌注损伤的影响. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2006， 41(4)： 293-296.

　　34 林颖， 邱建华， 乔莉，等. 心钠素对耳蜗微循环的影响. 听力学及言语疾病杂志，2006，14(5)：347-350.

　　35 林颖， 邱建华. 心钠素在豚鼠耳蜗微血管的分布. 第四军医大学学报， 2005， 26(7)： 581-583.

　　36 陈合新， 邱建华， 黄钻宏， 等. 压力波对豚鼠耳蜗血管纹、螺旋神经节心钠素免疫反应性影响. 中华创伤杂志， 1994， 10(6)：271-272.

　　37 Kitano K, Fukuda Y, Nagahira K, et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against human natriuretic peptide receptor-A or -B. Immunol Lett，1995， 47(3): 215-222.