顺铂及其耳毒性

　　作者：丁大连　 作者单位：Center for Hearing and Deafness, University of New York at Buffalo

　　【摘要】 顺铂是一种用于化疗的铂制剂，在临床上广泛应用于抗肿瘤治疗。然而由于顺铂所具有的肾毒性和耳毒性以及神经毒性等毒副作用，致使其临床应用受到一定的限制。顺铂损害耳蜗的三个主要靶目标分别是血管纹和毛细胞以及螺旋神经节，这三个靶目标在顺铂的作用下都以细胞凋亡的方式实现其程序化自我毁灭，因此顺铂耳中毒模型是一个典型的内耳细胞凋亡模型。顺铂造成的细胞内氧自由基活动增加和抗氧化酶类的活性丧失是产生细胞损害的重要因素之一，因而抗氧化治疗可有效降低顺铂对耳蜗中上述三个靶目标的破坏程度。顺铂在Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)径路上激发的毛细胞凋亡是首先启动Caspase-8的活动，说明毛细胞膜表面的细胞死亡因子受体是顺铂诱导毛细胞凋亡的一根导火索;螺旋神经节细胞的凋亡却是被顺铂同时启动了Caspase-8和Caspase-9，因此螺旋神经节细胞的凋亡不但是因为细胞膜表面的死亡因子受体因受顺铂刺激而发出凋亡的信号，而且还会被从线粒体释放出的细胞色素C启动其凋亡自毁程序。肿瘤抑制基因p53是出现在顺铂耳中毒早期的一个促使细胞凋亡的重要“杀手”，应用Superarray技术发现顺铂激发的耳蜗毛细胞和螺旋神经节凋亡基因主要涉及p53，肿瘤坏死因子家族，Death domain family(死亡结构域家族), Bcl-2 family, Card family(Caspase相关的招募域家族)，和GTP signal transdution(三磷酸鸟苷信号转导)等多条凋亡通路，其中p53信号通路是顺铂诱导毛细胞和螺旋神经节凋亡的主线，因此应用p53抑制剂-Pifithrin α可以通过有效阻止p53的活动而减轻顺铂诱导的毛细胞凋亡。分裂素激活的蛋白激酶在顺铂诱导的内耳细胞凋亡过程中也扮演了重要的角色，应用PD98059可以通过暂时抑制分裂素激活的蛋白激酶活性和p53磷酸化以及Caspase的活动延迟耳蜗毛细胞凋亡的起始阶段，但不能完全阻止病变的扩展，因而PD98059对顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡仅具有短期保护效应。

　　【关键词】 顺铂，耳毒性，细胞凋亡

　　Cisplatin and its ototoxicity

　　DING Da-lian, QI Wei-dong, ZHANG Mei, WANG Ping, JIANG Hai-yan, Richard Salvi

　　1　Center for Hearing and Deafness, State University of New York at Buffalo

　　2　Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

　　3　Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, the First Affiliated Hospital, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130021, China

　　【Abstract】　Cisplatin is an antineoplastic agent that is frequently used for chemotherapeutic treatment of various cancers. However, the clinic application of cisplatin is restricted by its side effects of nephrotoxicity, ototoxicity, and neurotoxicity. Three major targets of cisplatin action in the cochlea are the stria vascularis, the hair cells, and the spiral ganglion neurons. In these regions, the cells die by apoptosis after the cisplatin treatment. Cisplatin treatment increases the production of free radicals and reactive oxygen species, and causes a decline in antioxidant enzymes which can lead to apoptosis by activating caspases, a family of cysteine-aspartate-specific proteases. The treatment of antioxidants therefore can protect cochlear hair cells from cisplatin insult. In the cispaltin-induced caspase apoptotic pathway, caspase-8 is first activated in the hair cells, indicating that the involvement of the death receptor pathway and caspase-8 as the apoptotic initiator in hair cells. In contrast, the spiral ganglion neuron death features the activation of both caspase-8 and caspase-9 at the early stage of the cell death process following the cisplatin treatment. This suggests that the cell death signals in spiral ganglion neurons are released from both the cell death factor receptors on the cell membrane and cytochrome C leakage from the mitochondria. p53, a tumor suppressor gene, is activated in response to DNA damage, stress, and many chemotherapeutic agents including cisplatin. p53 triggers the initiation of cell apoptosis that involves caspase activities in the early stage of cisplatin damage. Using superarray technology, a multiple apoptotic pathways are detected after the cisplatin treatment, including the p53 signaling pathway, tumor necrosis factor receptor superfamily, death domain family, Bcl-2 family, CARD family, and GTP signal transduction. Pifithrin-αis a powerful inhibitor of p53, and greatly enhances hair cell survival from cisplatin damage. Mitogen activated protein kinases also play an important role in cisplatin-induced cell apoptosis. PD98059, an inhibitor of mitogen activated protein kinases, can temporally protect cochlear hair cells by inhibiting the mitogen activated protein kinases, ERK phosphorylations, p53 phospholyrations, and caspase activation. However, the application of PD98059 can only delay the onset of the damage, but can not completely block the progression of the death process.

　　【Key words】　Cisplatin;　Ototoxicity;　Cell apoptosis

　　1　抗肿瘤类药物铂制剂

　　临床应用铂配位络合物治疗恶性肿瘤已有30余年的历史。自1969年Rosenberg首次报道了顺铂(Cisplatin，DDP)的抗癌效应之后[1]，许多科学工作者对铂类抗肿瘤药物进行了广泛深入的研究。1971年顺铂被首次应用于恶性肿瘤病人的治疗，7年后该类药物已在美国及加拿大成为治疗实体性肿瘤的常规用药, 随后顺铂在全世界范围内被广泛应用于肿瘤患者的治疗。铂制剂由于抗肿瘤谱广和临床效果显著日益成为治疗肿瘤的重要化学药物。迄今为止，通过实验室合成的铂络合物虽然已经超过2000种，但在全世界范围内获准临床使用的只有顺铂和卡铂(Carboplatin);除此之外，还有两种铂配合物在某些国家和地区得到认可，它们是卡铂奥沙利铂(Oxaliplatin)和奈达铂(Nedaplatin)，当然目前还有一些新型的铂制剂正处于实验验证阶段或临床试用阶段。铂在体细胞内的吸收与代谢过程目前还不十分清楚，由于细胞内的顺铂浓度在用药后60分钟仍可保持良好的线性增长关系，而且细胞内的铂浓度并不超过细胞外的药物浓度，因此最初认为顺铂可能是通过被动扩散的方式进入到细胞内。然而，近年来的一系列研究表明铜与细胞内铂的浓度之间存在着直接的相关性，铂的吸收、转运及代谢似乎与铜的相关药代动力学有着类似的平行关系。细胞内存在一种与铜及铂具有高度亲和力的转运蛋白—CTR1，CTR1基因突变或缺失常常导致肿瘤对顺铂等铂制剂的抗药性增强或者出现细胞内铂水平的下降。另外，调节细胞内铜离子水平的铜转运P型三磷酸腺苷酶(ATP7A，ATP7B)也可对铂的吸收代谢产生重要影响，在离体环境下细胞内铜离子水平的高低与多种肿瘤细胞所产生的耐药性有关[2, 3]。实验证实，ATP7A与ATP7B在功能上存在很大差异，过度表达ATP7A会减少顺铂及卡铂在细胞内的聚积并引起这两种药物快速从细胞内排出，然而ATP7B则可以促使顺铂或卡铂或奥沙利铂在细胞内聚积，但同时也增强了细胞对药物的耐受性。进一步的研究证实ATP7B可与药物结合并使其远离作用靶点，这也就解释了为什么ATP7B既可增加铂制剂在细胞内的浓度又可以有效减轻药物对细胞的损害[4]。细胞对顺铂的吸收及排出与铜代谢水平有关的现象说明铜与铂可能具有相同的代谢途径，也就是说铜和铂很可能都是通过细胞膜上的铜离子转运蛋白(copper transporter)进入细胞。研究证明铜和铂确实可以互相影响彼此在细胞内的浓度水平，这很可能意味着铜和铂之间存在着竞争性抢占铜离子转运蛋白的现象，即如果通道被铜占据则铂的进入减少，反之则铂的进入量增加而使细胞内的铜水平下降。因此研究铜离子转运蛋白有可能成为探讨铂制剂在细胞内代谢的一个新的突破口。

　　2　顺铂的药理效应及毒副作用

　　2.1　顺铂的药理效应

　　顺铂是铂的金属络合物，其作用类似于烷化剂。顺铂进入细胞后，与Cl- 发生水合作用形成[Pt(NH3)2Cl(OH2)] + 和 [Pt(NH3)2(OH2)2]2+，水合后的顺铂明显增强了其对细胞内靶目标的攻击性。虽然顺铂可与许多细胞成分相互作用，但DNA是顺铂的主要生物学靶点。顺铂中的铂原子在N7位置与嘌呤碱基以共价键结合，并以此形成在1， 2和/或1， 3核苷酸链内交联及链间交联。顺铂与DNA的交联是通过氯离子(Cl-)，而卡铂和奥沙利铂与DNA的交联则分别是通过环丁烷-1，1乙二酸(Cyclobutane-1,1-Dicarboxylate)和草酸盐配基(Oxalate ligands)。顺铂进入肿瘤细胞后首先水解为羟烃氨铂，多以单链内联结构在细胞DNA的链间及链内以交链形式形成DDP-DNA复合物，或与核蛋白及胞浆蛋白质结合并以此干扰DNA的复制。顺铂属于一种细胞周期非特异性药物，因此对生长各期的肿瘤细胞均有杀伤作用。顺铂与DNA发生交联后，修饰并扭曲了DNA的双螺旋结构，使链内的1， 2交联双链结构向着DNA双螺旋结构表面的大沟(Major groove)方向弯曲，使DNA较浅的小沟暴露并易于与蛋白相结合。这些被结合的蛋白质包括：高迁移率族蛋白(high-mobility group box proteins，HMG-Box proteins)，修复蛋白(Repair proteins)，转录因子(transcription factor)，组蛋白H1(histone H1)等，这些蛋白质都能够识别1， 2链内交联的铂-DNA加合物并通过与之相结合构成对DNA的损害。在HMG-Box蛋白家族中，HMGB1涉及许多DNA的依赖路径，它可以激发重组激活基因RAG1和RAG2的裂解并促进序列特异性转录因子的结合。此外，HMGB1可以对DNA错位修复蛋白MutSα1的作用产生干扰。在离体实验中，HMGB1可与肿瘤抑制蛋白(Tumour-suppressor protein)p53相互作用，由于p53的活动可以增强HMGB1与顺铂—DNA加合物的亲和力，因此p53与HMGB1之间的相互作用可以被看做是顺铂抗肿瘤效应的主要分子机制。顺铂导致的DNA损伤涉及许多信号转导路径，近年来在应用v-akt鼠胸腺病毒致瘤基因同系物(v-akt murine thymoma viral oncogene homologue，AKT)，v-abl Abelson 鼠白血病病毒致瘤基因同系物1(v-abl Abelson murine leukaemia viral oncogene homologue 1， c-ABL)，p53基因表达，细胞分裂素活化蛋白激酶/c-Jun氨基端激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/JNK/ERK)及相关的顺铂细胞毒性路径等方面取得很大进展，这些研究新进展为确定顺铂的毒副作用机制和制定针对性有效治疗方案提供了重要的理论基础。此外顺铂还是一种非常有效的放疗增敏剂，在进行60钴放射治疗的同时应用顺铂进行化疗，可有效提高歼灭肿瘤的治疗效果。

　　顺铂在静脉注射或动脉给药或腔内注射时吸收速率都极为迅速。顺铂进入体内后主要分布在肝、肾、前列腺、膀胱、卵巢，亦可出现在胸腔和腹腔，但极少通过血脑屏障。顺铂主要经肾脏通过肾小球过滤或经肾小管分泌排出到体外，一般在用药后96小时顺铂总量的25% ～ 45%可随尿液排出。局部应用顺铂可使药物在该器官内的浓度比静脉注射后分布到局部器官内的药物浓度高2.5 ～ 8.0倍，因此对肿瘤腔或者肿瘤区域进行顺铂局部注射往往可以达到更好的抗肿瘤效果。

　　2.2　顺铂的毒副作用主要表现在如下几个方面

　　(1)顺铂对肾脏的损害作用：顺铂在肾脏的累积和剂量相关性肾功能不良是顺铂的主要限制性毒性，如果顺铂的每日剂量超过90 mg/m2即可引发肾毒性症状，肾脏的损害部位主要是肾小管。肾脏的急性损害大多出现在用药后10~15天，血尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)会因此而明显增高，而肌酐清除率则相应有所降低，但这些肾功能损害大多为可逆性。然而如果反复应用顺铂或者大剂量长时期使用顺铂也可导致永久性的轻度或中度肾脏损害。目前除了水化疗法之外尚缺乏其它行之有效的防止顺铂肾毒性的手段。(2)顺铂对神经的损害作用：顺铂引起的末梢神经中毒症状与顺铂的累积剂量的大小直接相关，主要表现为手脚的套样感，感觉减弱甚至丧失，有时还会出现肢端麻痹、手脚痉挛或躯干肌力下降等表现，顺铂引起的神经损害症状一般都难以恢复。 (3)顺铂对听觉系统的影响：注射顺铂后可出现耳鸣和听力下降等症状，顺铂引起的耳聋大多为不可逆。 (4)顺铂对消化系统的影响：注射顺铂后出现的严重恶心呕吐是顺铂限制性毒性的另一个重要因素，顺铂引起的急性呕吐一般总是发生在给药后1 ～ 2小时，这样严重的恶心呕吐往往可持续一周左右。 (5)顺铂对骨髓的抑制作用：注射顺铂后可出现白细胞和血小板的下降，其发生几率与顺铂的疗程和剂量有关，如果顺铂的应用剂量小于100 mg/m2，血象改变的发生机率为10% ～ 20%，但是如果顺铂的应用剂量大于120 mg/m2，血象改变的发生机率可上升到40%。当然如果应用顺铂和其它具有骨髓抑制效应的抗癌药进行联合化疗，则骨髓毒性必然会因重叠效应而加重。(6)顺铂可能诱发过敏反应：对顺铂过敏的患者会出现脸肿，气喘，皮疹，低血压，甚至心动过速等症状。(7)顺铂引发的心脏功能异常和肝功能异常偶见发生。(8)顺铂引起视神经乳头水肿或者球后视神经炎亦有报道。

　　3　顺铂的耳毒性作用

　　大剂量应用顺铂可以导致双耳发生进行性感音神经性耳聋。由于顺铂抗肿瘤效应取决于药物的浓度，即短时间内每次给药的浓度越高则疗效越好，然而大剂量顺铂的抗肿瘤效果越好，其引发肾毒性和耳毒性的风险也就越大。目前临床上对使用顺铂的肿瘤患者通过水化疗法和利尿剂的应用，已经使顺铂肾毒性的副作用大大减轻。然而顺铂的耳毒性仍然是影响该药使用乃至停药的极重要因素，因此开展顺铂耳毒性的研究和防治具有重要的临床意义。顺铂引起的感音神经性聋在肿瘤患者当中占有相当的比例，尤其较多出现在大剂量应用顺铂之后或者伴有严重肾功能障碍的病例，因此在临床实际应用中注意合理用药，并根据肿瘤患者的具体病情和全身健康状况，适当采用分割小剂量全身用药或者采用局部用药，注意监控和维持患者的肾功能等项措施都将有助于把顺铂的耳毒性副作用控制在最低水平。

　　除了在临床上慎重应用顺铂和加强支持疗法之外，开展必要的动物实验以掌握顺铂耳毒性的规律并探讨其耳中毒机理，进而根据顺铂损害听觉器官的机制寻求针对性的有效保护措施，最终将根据经过动物实验验证的可靠研究成果逐渐过渡到临床，为应用顺铂的肿瘤患者提供一些有效的听觉保护，是我们研究顺铂耳毒性的强大动力，也是我们的最终目的。

　　大量动物实验证明，顺铂可使实验动物发生听觉障碍并伴随听觉器官的永久性损害。内耳病理检查发现，这些损害主要发生在耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞[5]，说明顺铂不但破坏听觉器官的感觉上皮而且损害周边的听觉神经元。我们最近研究了荧光标记的顺铂被耳蜗毛细胞摄取的过程，发现顺铂首先被毛细胞摄取而耳蜗支持细胞摄取顺铂的能力相对较弱[6]，提示毛细胞是顺铂的主要靶目标。静脉或腹腔注射顺铂引起的动物外毛细胞损害首先从耳蜗底回开始并逐渐向顶回发展，内毛细胞的破坏同样遵循从底回向顶回的发展规律，但外毛细胞的损害比内毛细胞发生得早，因此动物总是首先发生外毛细胞的功能障碍并伴有高频听力的损失，随着内、外毛细胞损害范围的扩大，低频听力也随之受到影响。顺铂损害螺旋神经节的作用应该归因于顺铂的神经毒性作用，但顺铂是否对中枢听觉系统也同样具有直接的损害作用，目前还不十分清楚。顺铂不但破坏周边听觉系统，而且对内耳前庭各终器同样具有损害作用。因此顺铂的内耳毒性应该包括耳蜗毒性和前庭毒性两个方面，而在耳蜗和前庭又都各自包含着周边感觉毛细胞和周边神经元的病理性损害。

　　实验证实顺铂耳中毒早期出现的听功能障碍除了发生听神经动作电位阈值的升高和耳蜗微音器电位(cochlear microphonic potential)的振幅下降之外，还伴随着内淋巴电位(endocochlear potential)的降低，提示顺铂对蜗管外壁上的血管纹也有损害作用。形态学检查发现在顺铂破坏血管纹的过程中，所有被破坏的血管纹上皮都具有细胞凋亡的特征，这些发生在血管纹的细胞凋亡现象被认为是由于顺铂刺激了上皮细胞的钾通道而造成细胞内的钾外流(potassium efflux)，从而使细胞内的离子浓度和渗透压发生改变，并因此而激活了细胞内凋亡酶的活动[7]，如Caspase的家族成员和凋亡核酸酶(pro-apoptotic nucleases)的活动就是因顺铂耳中毒而触发，导致血管纹上皮细胞的凋亡。因为在离体培养实验中发现应用钾离子通道抑制剂可以有效降低顺铂引起的Caspase活动以及DNA螺旋结构的破坏等细胞凋亡活动，因此细胞内的低钾浓度可能是促使Caspase和凋亡核酸酶启动的主要原因之一，这些凋亡酶类对蛋白质的分解 (proteolytic activity)被认为是顺铂引起血管纹细胞凋亡的主要　机制。

　　最初的动物实验研究发现顺铂引起的听神经动作电位阈值升高的幅度比微音器电位的振幅下降幅度要大得多，由此可以看出听神经动作电位的功能改变并不是唯一地取决于外毛细胞的功能障碍，即使考虑到内淋巴电位降低的因素，也仍然无法解释听神经动作电位发生如此严重的功能障碍。随着研究的逐渐深入，螺旋神经节纤维表面髓鞘被破坏的现象终于也被发现，至此顺铂对听神经动作电位的影响被认定来自三个方面，它们分别是血管纹功能障碍所产生的内淋巴电位降低和外毛细胞功能障碍所导致的耳蜗微音器电位下降以及螺旋神经节神经纤维表面髓鞘的崩解。因此可以说顺铂在耳蜗周边的三个主要破坏靶目标分别是蜗管外壁的血管纹和基底膜上的Corti氏器以及蜗轴内的螺旋神经节。在顺铂耳中毒过程中，作为反映外毛细胞功能状态的耳声发射畸变产物(Distortion product otoacoustic emissions)也发生相应的振幅降低，作为反映整个听觉通路功能状态的听性脑干反应(Auditory Brainstem Responses，ABR)亦在高频听力首先发生显著的阈移。有必要强调的是，上述耳蜗三大结构包括Corti氏器，血管纹和螺旋神经节所出现的损害均发生在顺铂耳中毒的早期，因此可以说三者都是顺铂耳毒性的原发病变部位[8]，尽管其各自的损害原因和机制可能有所不同，但都有一个共同的特点，那就是不管是在毛细胞还是在神经元或者在血管纹上皮，其细胞死亡的模式都表现出细胞凋亡的典型特征，即都发生明显的细胞核固缩(nuclear shrinkage)和细胞核破裂(nuclear fragmentation)。因此顺铂耳中毒动物模型成为研究毛细胞凋亡和螺旋神经节细胞凋亡以及血管纹上皮细胞凋亡的理想研究对象。

　　4　顺铂激发的氧自由基活动和抗氧化保护作用

　　顺铂与耳蜗组织结合后可激发产生大量的自由基[9]，诸如超氧化物(superoxide)，过氧化氢(hydrogen peroxide)，毒性脂质过氧化物(toxic lipid peroxides)等，这些氧自由基的增加可引起耳蜗毛细胞内的钙离子浓度增高并因此而导致毛细胞凋亡。顺铂在增加细胞内自由基活动的同时，还可明显降低耳蜗组织中抗氧化酶类的活性[10]。顺铂抑制耳蜗组织中抗氧化酶活性的现象被认为存在以下几种可能机制： (1) 顺铂分子进入细胞后可直接与抗氧化酶类的巯基相结合，从而使多种抗氧化酶类失活;(2)顺铂进入细胞后耗空细胞内的铜和硒，使超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和谷胱甘肽过氧化物酶丧失活性;(3)顺铂进入细胞后可通过增加细胞内过氧化氢的含量而抑制抗氧化酶类的活性;(4)顺铂耗空细胞内的谷胱甘肽(glutathione，GSH)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，并因此而抑制了谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性。

　　大量实验证实，注射顺铂后可使耳蜗内的谷胱甘肽(glutathione，GSH)和抗氧化酶(antioxidant enzymes)系统耗尽，诸如过氧化物歧化酶，过氧化氢酶(catalase)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)等，并因此而导致耳蜗细胞内的脂质过氧化反应(lipid peroxidation)。耳蜗内谷胱甘肽水平的下降和谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低，说明氧自由基在顺铂耳中毒早期扮演着重要的角色。有人曾经应用抗氧化疗法不同程度地降低了顺铂对毛细胞和螺旋神经节的损害程度，例如硫代硫酸钠(sodium thiosulfate)，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽，过氧化物酶(peroxidase)，甲硫氨酸(D-methionine)，氨磷汀(S-2-(3-amino-propylamino)-ethylphosphorothioic acid，WR-2721)，普鲁卡因(procaine)，普鲁卡因氨基化合物(procaine amide)，二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate)，4-methylthiobenzoic acid(MTBA，4-甲硫基苯甲酸)，以及其它含硫的化合物(sulfur-containing compounds)等，对顺铂引起的耳毒性损害和肾毒性损害均起到一定的保护作用，其中以谷胱甘肽和二硫代氨基甲酸盐以及methylthiobenzoic acid等抗氧化制剂的保护效果更为理想。鉴于氧自由基的活动很可能发生在顺铂耳中毒的早期阶段并且发生在细胞凋亡之前，上述抗氧化制剂对顺铂耳毒性、肾毒性和神经毒性的有效防护，一方面说明氧自由基在顺铂耳中毒过程中所起到的破坏作用不容忽视，同时也提示早期应用抗氧化剂对于减轻顺铂的耳毒性不失为一种行之有效的积极保护措施。然而全身应用上述抗氧化制剂尽管可以对组织细胞产生一定的保护作用，但是都存在着一个致命的弱点，那就是这些抗氧化制剂或多或少都具有削弱甚至抵消顺铂抗肿瘤效应的作用。有鉴于此，在耳蜗局部应用抗氧化剂成为当前对抗顺铂耳毒性的有效防护措施之一。目前唯一经过动物实验验证，既可保护听觉系统又不影响顺铂抗肿瘤效应的有效方法是将甲硫氨酸经圆窗膜途径渗透进入耳蜗[11]，此成功范例为进一步开展防治顺铂导致的耳聋提供了有益的经验。

　　水杨酸盐除了具有解热镇痛的药理作用之外，还可以抑制细胞凋亡，同时也是一种有效的自由基清除剂。Thun等报道，水杨酸钠还具有一定的抗肿瘤效应，因此水杨酸钠作为一种治疗肿瘤的化疗辅助剂日益引起人们的关注。据李歌明等的动物实验研究[12]，全身应用水杨酸盐不仅有效抵挡了顺铂对大鼠的耳毒性和肾毒性，而且没有干扰顺铂对乳癌大鼠肿瘤细胞的破坏效应。提示应用适量水杨酸盐可能对顺铂造成的内耳损害具有一定的保护作用，同时由于全身应用水杨酸盐理论上并不削弱甚至有可能增强顺铂的抗肿瘤效应，因此水杨酸盐在顺铂耳聋防治方面的研究值得引向深入。然而由于水杨酸盐也是一种耳毒性药物，因此在实际应用中考虑如何充分发挥其保护组织的积极因素同时又要尽可能避免或减轻其消极因素，也是一个值得研究的课题。

　　5　顺铂与利尿酸钠的协同耳毒性作用

　　鉴于顺铂很难穿越血-脑屏障，因而在实验性哺乳类动物模型制备中，往往需要反复用药以逐渐增加顺铂在脑和内耳的浓度，然而有时在内耳液中还没有来得及积累到顺铂破坏内耳的有效浓度，动物却已经因为顺铂的肾毒性或骨髓抑制等毒副作用发作而死亡，因此建立顺铂系统用药引起的耳中毒动物模型有时颇费周折。利尿酸钠可以有效阻断耳蜗蜗管外壁的血流，从而使血管纹上皮细胞因缺血缺氧而发生暂时性破坏[13]。由于血管纹是血-迷路屏障的重要组成部分之一，因此利尿酸钠对血管纹的暂时性破坏作用可被考虑将其用做打开血-迷路屏障的一把钥匙[14]。当我们对灰鼠进行静脉注射利尿酸钠(40 mg/kg)之后立刻腹腔注射顺铂，使顺铂可乘血管纹被暂时破坏之机及时穿越开放的蜗管外壁血-迷路屏障进入耳蜗，在这样的一次性攻击中，即使应用很低的顺铂剂量(0.2mg/kg)也就足以引起50%以上的耳蜗内、外毛细胞凋亡;如果按照每公斤体重0.8毫克的剂量注射顺铂，则可在用药后48小时内100%剿灭全耳蜗的内、外毛 细胞[15]。

　　6　顺铂激发的Caspase(半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶)凋亡途径

　　为了探讨顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡是否与Caspase的活动有关，我们应用荧光标记的Caspase 抑制剂(Caspase inhibitor)探测了联合应用顺铂和利尿酸钠的灰鼠模型。发现在注射顺铂和利尿酸钠后6小时，首先在部分外毛细胞中出现Caspase-8的启动，但是没有发现Caspase-9和Caspase-3以及Caspase-6的活动，提示Caspase-8可能在顺铂引起毛细胞凋亡的Caspase路径中是一个重要的启动器。注射顺铂和利尿酸钠后12小时，所有外毛细胞中均显示出Caspase-8，Caspase-3和Caspase-6的活动同时伴有明显的细胞核凝缩，但仍然没有Caspase-9的启动。注射顺铂和利尿酸钠后24小时，所有外毛细胞中显示强烈的Caspase-8，Caspase-3和Caspase-6阳性产物，Caspase-9却依然保持着“沉默”。直到注射顺铂和利尿酸钠后48小时，Caspase-8和Caspase-6的活动消失，尽管此时在许多外毛细胞中由于细胞核碎裂成极小颗粒以致于难以看到细胞核的存在，但是Caspase-3仍然在那些看似“无核”的毛细胞中显示强阳性，在个别尚未被完全破坏的外毛细胞中，此时才可看到Caspase-9的弱阳性反应，Caspase-9在毛细胞凋亡末期才姗姗来迟的现象提示Caspase-9的活动可能只不过是顺铂和利尿酸钠诱发毛细胞凋亡的一种继发性改变[15]。

　　Caspase-8作为Caspase家族的一种启动细胞凋亡的启动子，仅对位于细胞膜表面的细胞死亡因子受体的刺激起反应。Caspase-8在联合应用顺铂和利尿酸钠引起的毛细胞凋亡过程中首先被激活的现象说明顺铂诱导凋亡的病变始发部位很可能就是细胞膜表面的细胞死亡因子受体。为了验证这一可能性，我们应用Tumor necrosis factor Receptor Associated Death Domain(TRADD，肿瘤坏死因子相关死亡域蛋白)和Fas Associated Death Domain (FADD，接头蛋白)免疫组织化学方法分别观察了位于细胞膜表面的TRADD和FADD的表达，结果证实TRADD和FADD均在顺铂耳中毒早期表现出强烈的阳性反应[15]，说明Caspase-8的启动确实是被细胞膜表面的细胞死亡因子受体所激活。

　　Caspase-9是Caspase家族中另一种细胞凋亡的启动子，仅仅对线粒体破坏后释放到细胞质中的细胞色素C(Cytochrome C)与Apaf Ⅰ(凋亡蛋白激活因子-1)的结合产物起反应，由于在联合应用顺铂和利尿酸钠引起的毛细胞凋亡早期没有出现Caspase-9的活动，因此可以判定顺铂引起的毛细胞凋亡并非起始于线粒体凋亡路径。

　　Caspase-3和Caspase-6都是位于Caspase-8和Caspase-9下游的Caspase终结者，或称之为死刑执行者(Executioner)，它们均可被Caspase-8和Caspase-9启动而对细胞痛下杀手以实现最终的细胞凋亡，由于Caspase-9在顺铂引起的毛细胞凋亡早期并未启动，因此在顺铂引起的毛细胞凋亡中所出现的Caspase-3和Caspase-6的活动只能归因于Caspase-8的启动，说明膜表面的细胞死亡因子受体才是顺铂激发毛细胞凋亡的导火线。我们在最近的耳蜗离体培养实验中还发现，螺旋神经节凋亡和毛细胞凋亡在顺铂耳中毒引起的Caspase活动有着不同的表现。在顺铂损害的早期，螺旋神经节细胞中不仅立刻出现Caspase-8的活动，而且Caspase-9也同时被激活。从神经元中这两个不同的Caspase启动子同时被激活的现象可以看出，顺铂引起的神经元凋亡可能是同时点燃了两根导火索，一根导火索是细胞膜表面的死亡因子受体，而另一根导火索就是从线粒体释放出的细胞色素C。从Caspase这两个启动子在顺铂诱导的神经元凋亡和毛细胞凋亡的不同反应可以看出，顺铂诱导的毛细胞凋亡机制和螺旋神经节凋亡机制可能并不完全相同。

　　7　顺铂引起的p53凋亡活动

　　p53是一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)，在各种原因引起的DNA损伤或细胞应激反应过程中都可能由于p53的启动而实现细胞的凋亡，因此p53成为一名重要的细胞凋亡职业杀手。我们在顺铂损害耳蜗毛细胞和前庭毛细胞的器官培养模型中发现了大量的p53免疫组化阳性产物，说明p53在顺铂引起的毛细胞凋亡中扮演了一个重要的角色[16]。由于Caspase的活动与p53凋亡路径也存在着密切联系，因此我们可以初步确定顺铂引起的毛细胞凋亡关键路径主要涉及到细胞膜表面的细胞死亡因子受体和p53的活动。

　　8　应用Superarray基因芯片技术探测顺铂诱发的凋亡基因活动

　　为了深入了解顺铂引起耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞凋亡的可能性分子机制，我们应用Superarray技术分别观察了顺铂引起的全耳蜗基底膜和螺旋神经节细胞或单纯基底膜上皮组织或单纯螺旋神经节细胞中凋亡基因表达的早期改变[17]。结果发现经0.2 mmol/L顺铂培养12小时后，全耳蜗基底膜和螺旋神经节细胞中的绝大部分凋亡基因的表达都明显减弱，但是只有两个基因的表达显著增强，而这两个基因(Tnfaip2和Tnfrs12a)正是肿瘤坏死因子受体家族的成员并且恰好与细胞膜表面的细胞死亡因子受体的活动密切相关。由于应用顺铂培养耳蜗组织12小时已经是处于毛细胞凋亡的中期或末期阶段，此时大部分凋亡基因的表达丧失或减弱并不让人感到奇怪，因此我们并不认为这一结果会对我们探讨顺铂的早期耳中毒机理提供太大的帮助。值得注意的是，在0.2 mmol/L顺铂培养3小时的耳蜗基底膜组织和螺旋神经节细胞中，没有发生任何凋亡基因的表达减弱，相反却有9个基因显示出明显的表达增强，这9个基因主要涉及p53信号通路(p53 signaling pathway)，肿瘤坏死因子家族(tumor necrosis factor receptor superfamily)，DDF(death domain family，死亡结构域家族)，Bcl-2 family，CARD family(caspase-associated recruitment domain，caspase相关的招募域家族)，和GTP signal transduction(三磷酸鸟苷信号转导)。在0.2 mmol/L顺铂培养3小时的单纯耳蜗基底膜上皮组织中，我们发现有12个基因呈现过度表达，这12个基因所涉及的细胞凋亡通路除了比全耳蜗基底膜和螺旋神经节细胞多一条Interacting predicted protein(TRAF)凋亡通路之外，其余的凋亡通路与全耳蜗基底膜和螺旋神经节细胞的凋亡通路一样甚至多数基因的名字也相同，但也有少数基因不一样。在这12个最早发生变化的基因中，有两个基因属于抗凋亡基因，而其余的10个基因都是凋亡基因。在0.2 mmol/L顺铂培养3小时的螺旋神经节细胞中出现11个基因呈现过度的表达增强，这11个基因涉及的神经元凋亡通路与基底膜细胞的凋亡通路相似，但不包含TRAF凋亡通路，在这些过度表达的基因中，有些基因曾经同样出现在基底膜的上皮细胞中，但有些基因却不一样[17]。上述结果表明顺铂引起的基底膜上皮细胞凋亡和螺旋神经节细胞凋亡有着类似的细胞凋亡路径，但在它们之间出现的那些不同的细胞凋亡调控基因则可能反映出这两种不同组织细胞的独特凋亡表现。尽管螺旋神经节细胞和基底膜上皮细胞的凋亡细节有所不同，但有一点可以肯定的是，p53凋亡途径是顺铂导致耳蜗毛细胞和螺旋神经节凋亡的一条共同的主线。

　　9　Pifithrin α对内耳毛细胞的保护作用

　　Pifithrin α(PFTα)是一种p53的抑制剂，我们在耳蜗和前庭器官培养系统应用PFT成功地阻断了p53凋亡通路，同时还有效抑制了Caspase-1和Caspase-3的活动，在很大程度上保护了毛细胞免受顺铂的损伤。这一结果不但表现在毛细胞的存活数量有显著增加[16]，而且经Superarray测试和PCR检验，证实了那些过度表达的凋亡基因和抗凋亡基因在PFT的作用下均受到不同程度的抑制，尤其是与p53凋亡通路密切相关的那几个基因，由于PFT对p53和Caspase的成功抑制，致使其表达水平几乎与正常组织的表达水平相同[17]。

　　10　顺铂引起的分裂素激活蛋白激酶的活动和PD98059抑制凋亡的作用

　　实验证实，除了p53凋亡路径和Caspase径路之外，分裂素激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)同样在顺铂耳中毒过程中参予了对毛细胞的破坏。PD98059是一种有效的抗凋亡制剂，可以抑制分裂素激活蛋白激酶的活动而有效阻止ERK(胞外信号凋节激酶)的磷酸化，同时也能减少p53的聚积而阻止p53的磷酸化，另外还可以抑制上游Caspase凋亡信号的传递径路(up-stream signaling pathways)。由于PD98059所具有的诸多抗凋亡效应，我们在顺铂破坏耳蜗毛细胞的培养模型中尝试了PD98059对毛细胞的保护作用，发现PD98059在顺铂培养24小时的耳蜗组织中确实有效地增加了毛细胞的存活数量，同时毛细胞中Caspase-8和Caspase-3的活动也暂时被抑制，但是当把耳蜗器官培养实验延长到48小时，这种保护效应却不复存在。由此可见，PD98059的作用可能只是延迟损害的发生而并不能完全阻止损害的发展。为了验证这个假设，我们应用Western Blot探测了耳蜗基底膜组织中的ERK磷酸化产物和p53磷酸化产物，结果证实PD98059在与顺铂共同培养耳蜗组织6小时后，与单纯顺铂培养的耳蜗组织相比，基底膜上皮细胞中的ERK磷酸化确实被PD98059有效抑制，在培养12小时后p53磷酸化也受到明显抑制，但是在培养24小时后，则p53的表达程度与单纯顺铂培养的耳蜗基底膜组织之间不再存在明显差别[18]。事后有学者建议我们应该考虑到PD98059之所以没有实现长效保护，有可能是由于在长时间培养过程中试剂失效而使其抗凋亡的效应被过早解除，我们同意这可能是没能实现PD98059长效保护的原因之一，但同时也考虑或许还存在着其它更复杂的因素，那就是一旦细胞凋亡涉及到多条凋亡路径则往往很难以一种有限的抑制因素阻断所有的凋亡通路。因此我们应该寻求并抑制顺铂损害毛细胞的最早启动子，而不是尝试与某一个或某几个最后的“杀手”进行决斗。PD98059对抗顺铂耳毒性的实验研究虽然没有达到预期的长效保护效果，但从其能够延迟毛细胞损害的现象可以看出，受PD98059抑制的几个凋亡杀手确实曾在顺铂引起的毛细胞凋亡过程中起到重要的破坏作用。

　　11　Caspase-3抑制剂是否可能保护顺铂诱导的毛细胞凋亡?

　　据报道，应用Caspase-3的抑制剂也可以保护耳蜗毛细胞和螺旋神经节免受顺铂的损害[19]，虽然Caspase-3 确实在顺铂激发毛细胞凋亡和螺旋神经节凋亡过程中起到决定性的破坏作用，但是Caspase-3的启动是取决于Caspase-8或者Caspase-9的活动，而Caspase-8或Caspase-9的活动不仅仅激活Caspase-3，而且同时激活Caspase-6和Caspase-7另外两个“职业杀手”。由于Caspase-3只不过是Caspase凋亡通路末端的“终结者”之一，因此如果单纯抑制Caspase-3但没有同时抑制其它Caspase的活动，恐怕也难以奏效，当然更谈不上阻断自由基活动和抑制p53等其它的细胞凋亡通路。有鉴于此，我们推测Caspase-3抑制剂在顺铂导致细胞凋亡晚期所表现出的保护效果恐怕非常有限。

　　12　神经营养因子是否可能保护顺铂诱导的毛细胞凋亡?

　　还有一些文章提出神经营养因子也能对抗顺铂引起的螺旋神经节损害[20]。在讨论这个问题之前应该首先明确三个前提，其一是神经营养因子不是任何凋亡基因和凋亡酶类的抑制剂，因此不可能阻止细胞凋亡的发生和发展;其二是神经营养因子对顺铂引起的耳蜗毛细胞凋亡不具有保护作用;其三就是顺铂的耳毒性机制并不是因为缺乏神经营养因子才导致螺旋神经节的死亡。神经营养因子是保持神经元存活和维持神经元正常功能的重要因素之一，耳蜗内的神经营养因子主要是由内毛细胞分泌，而顺铂系统给药对耳蜗毛细胞的破坏主要发生在外毛细胞，因此在顺铂损害毛细胞的诸多因素中并没有涉及神经营养因子的分泌障碍，因此可以认为顺铂破坏耳蜗毛细胞的现象与神经营养因子无关。当然在联合应用顺铂和利尿酸钠破坏大量内毛细胞后确实可以造成耳蜗内神经营养因子NT3(神经营养因子3)和BDNF(脑源性神经营养因子)的分泌减少，但实际情况是螺旋神经节的死亡是由于顺铂的直接神经毒性而并不是因为缺乏这些神经营养因子而产生的继发性退行性变化。如果假设螺旋神经节的破坏就是继发于神经营养因子的缺乏，那么神经元的破坏应该像氨基糖苷类抗生素耳中毒那样是在毛细胞被全部破坏后的相当一段时间才有可能发生，然而从顺铂耳中毒早期即发生螺旋神经节细胞凋亡的现象可以看出，这显然不是一种继发于神经营养因子缺乏所发生的延迟性神经元死亡。鉴于神经营养因子不可能终止顺铂激发的螺旋神经节凋亡，因此提供外源性神经营养因子对于并不缺乏神经营养因子的螺旋神经节来说无异于“竹篮打水”。提出神经营养因子具有对抗顺铂耳毒性观点的主要依据是神经营养因子在神经元的修复过程中可能起到重要的营养神经的作用，这个解释虽然可以勉强被接受，然而应该注意的是其前提充其量只不过是有可能协助拯救并向那些遭受“轻伤”但仍可望康复的神经元提供点额外的“营养品”以示关怀和慰问，至于那些因顺铂引起的氧自由基活动和DNA破坏以及一系列细胞自毁装置和凋亡基因的启动所造成的大多数神经元凋亡，显然都不在神经营养因子的“自然保护区”范围内。因此对于试图应用神经营养因子对抗顺铂耳毒性的研究策略，我们不抱太大的期望。

　　【参考文献】

　　1　Rosenberg B, VanCamp L, Trosko VH, et al. Platinum compounds: a new class of potent antitumour agents. Nature, 1969, 222(5191): p. 385-386.

　　2　Nitiss JL . A copper connection to the uptake of platinum anticancer drugs. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(22): 13963-13965.

　　3　Ohashi K, Kajiya K, Inaba S, et al. Copper(II) protects yeast against the toxicity of cisplatin independently of the induction of metallothionein and the inhibition of platinum uptake. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 310(1): 148-152.

　　4　Katano K, Safaei R, Samimi G, et al. Confocal microscopic analysis of the interaction between cisplatin and the copper transporter ATP7B in human ovarian carcinoma cells. Clin Cancer Res, 2004, 10(13): p. 4578-4588.

　　5　李兰，王重远. 顺铂耳毒性实验研究. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1990， 25(4): 205-207, 254.

　　6　Ding D, Jiang H, Salvi R. Cisplatin uptake into mammalian cochlear hair cells in vitro. Abstr Assoc Res Otolaryngol, 2007.

　　7　Marklund L, Andersson B, Behnam-Motlagh P, et al. Cellular potassium ion deprivation enhances apoptosis induced by cisplatin. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2004, 94(5): p. 245-251.

　　8　Hamers FP, Wijbenga J, Wolters FL, et al. Cisplatin ototoxicity involves organ of Corti, stria vascularis and spiral ganglion: modulation by alphaMSH and ORG 2766. Audiol Neurootol, 2003， 8(6): 305-315.

　　9　Lee JE, Nakagawa T, Kim TS, et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol, 2004. 124(10): 1131-1135.

　　10　Rybak LP, Whitworth C, and Somani S. Application of antioxidants and other agents to prevent cisplatin ototoxicity. Laryngoscope, 1999, 109(11): 1740-1744.

　　11　Li G, Frenz DA, Brahmblatt S, et al. Round window membrane delivery of L-methionine provides protection from cisplatin ototoxicity without compromising chemotherapeutic efficacy. Neurotoxicology, 2001, 22(2): 163-176.

　　12　Li G, Sha SH, Zotova E, et al. Salicylate protects hearing and kidney function from cisplatin toxicity without compromising its oncolytic action. Lab Invest, 2002, 82(5): 585-596.

　　13　Ding D, et al, Ethacrynic acid rapidly and selectively abolishes blood flow in vessels supplying the lateral wall of the cochlea. Hear Res, 2002, 173(1-2): 1-9.

　　14　丁大连， 蒋海燕， McFadden SL， 等. 利尿酸是打开血—迷路屏障的钥匙. 中华耳科学杂志， 2004， 2(1): 42-47.

　　15　Ding D, Jiang H, Wang P, et al. Cell death after co-administration of cisplatin and ethacrynic acid. Hear Res, 2007, 226(1-2): 129-139.

　　16　Zhang M, Liu W, Ding D, et al. Pifithrin-alpha suppresses p53 and protects cochlear and vestibular hair cells from cisplatin-induced apoptosis. Neuroscience, 2003, 120(1): 191-205.

　　17　Jiang H, Ding D, Qi W, et al. Cisplatin-induced changes in apoptotic gene expression in sensory versus neural subdivisions of rat cochlear cultures. Abstr Assoc Res Otolaryngol, 2007.

　　18　Ding D, Lanzoni I, Corbacelli E, et al. PD98059 protects cochlear hair cells from cisplatin. Abstr Assoc Res Otolaryngol, 2005.