血管紧张素转换酶I/D和血管紧张素Ⅱ受体1A1166C基因多态性与脑梗死的关系

血管紧张素转换酶I/D和血管紧张素Ⅱ受体1A1166C基因多态性与脑梗死的关系作者：和姬苓，孙洪英，王永福，杨国安，陈鹏    作者单位：014010包头医学院第一附属医院神经内科(和姬苓,孙洪英),基因诊断中心(王永福，杨国安，陈鹏)    【摘要】  目的 探讨血管紧张素转换酶（ACE）基因I/D多态性和血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)A1166C基因多态性与脑梗死（CI）的关系。方法 应用聚合酶链式反应限制性片断长度多态性（PCRRFLP）技术检测88例CI患者和90名健康对照者的ACE和 AT1R基因型和等位基因频率，并进行比较。结果 CI组AT1R基因AC基因型频率为31.8%，C等位基因频率15.9%，明显高于正常对照组（11.1%，5.6%）（均P＜0.05)；同时携带AT1R基因AC基因型和ACE基因DD基因型的个体CI的患病危险度为4.070（P＜0.05)；同时携带AT1R基因AC基因型和ACE基因ID基因型的个体CI的患病危险度为2.057（P＞0.05）。结论 AT1R基因A1166C基因多态性可能是CI发病的遗传因素；与ACE基因DD基因型间具有协同致CI作用。    【关键词】  脑梗死；血管紧张素转换酶；血管紧张素Ⅱ受体1；基因多态性    Relationship between the ACE gene I/D and AT1R gene A1166C polymorphisms and cerebral infarction  HE Jiling, SUN Hongying,WANG Yongfu, et al. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010,China    Abstract：Objective  To explore the relationship between angiotensin Iconverting enzyme (ACE) gene I/D and angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) gene A1166C polymorphisms and cereral infarction (CI). Methods  ACE and AT1R genotypes were investigated with the method of PCRRLFP in 88 patients with CI and compared with 90 agematched population controls. Results  AC genotypic frequency (31.8%) and C allele frequency (15.9%) of AT1R gene in CI group were significently higher than those in control group (11.1%, 5.6%) (all P＜0.05).The odds ratio for CI associated with the ACE DD genotype and AT1R AC genotype was 4.070 (P＜0.05). The odds ratio for CI associated with the ACE ID genotype and AT1R AC genotype was 2.057（P＞0.05）.Conclusions  The polymorphism of  AT1R A1166C  is  related to the incidence of CI. There are synergistic effects of ACE DD genotype and AT1R gene A1166C polymorphisms on the risk of CI.    Key words：cerebral infarction; ACE; AT1R; gene polymorphism    脑梗死（CI）的发生受到环境与遗传因素的双重影响，目前有许多研究［15］关注于血管紧张素转换酶（ACE）基因I/D多态性及血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)基因A1166C多态性与CI的关系。本研究运用聚合酶链反应限制性片断长度多态性（PCRRFLP）及酶切结合银染色技术检测CI患者ACE基因I/D多态性和AT1R基因A1166C的多态性，探讨ACE和AT1R基因多态性与CI的关系及相互作用。1  对象与方法    1.1  对象  （1）CI组：系2004年1月～2006年8月本院神经内科就诊的CI患者88例,男45例，女43例；年龄34～78岁，平均（63.5±11.6）岁。符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头部CT和/或MRI证实。（2）正常对照组：为同期本院健康体检者90名, 男46名，女44名;年龄27～69岁，平均（60.6±9.1）岁；均经过临床和/或影像学检查排除CI。两组的年龄、性别、体质量指数（BMI）具有可比性。    1.2  方法    1.2.1  DNA样品的提取  采集入组者静脉血2 ml，储存于EDTANa2抗凝管，常规酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA备用。    1.2.2  ACE I/D基因多态性的检测  采用PCR技术，引物设计参照文献［6］，上游为：5′CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3′；下游为：5′GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3′。反应在PCR扩增仪（Biometra PC48型）上进行，制备好的模板DNA 3 μl, 加入PCR反应混合液，反应体系25 μl，含引物各0.7 μl，2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μl 。混匀后，液体石蜡封顶进行PCR反应，预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 60 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果。    1.2.3  AT1R基因A1166C多态性检测  应用PCRRFLP技术，AT1R基因引物设计参照文献［7］，上游：5′ATAATGTAAGCTCATCCACC3′,下游：5′GAGATTGCATTTCTGTCAGT3′。反应体系25 μl，模板DNA 2.5 μl，引物各1 μl，2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μl 。混匀后，液体石蜡封顶行PCR反应。94℃预变性2 min，94℃变性60 s，退火56℃ 60 s，72℃ 延伸60 s， 35个循环后再72℃延伸5 min，4℃恒温保存。扩增产物10 μl加5 U限制性内切酶DdeⅠ及酶切缓冲液，37℃水浴12 h酶切反应，将产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果。

    1.2.4  统计学方法  应用SPSS 11.5软件，基因型及等位基因频率应用基因计数法并通过χ2检验；基因型及等位基因相对风险率以比值比（OR）及95%可信区间（CI）表示；HardyWeinberg平衡定律进行群体平衡验证。2  结  果    2.1  两组ACE基因型及等位基因频率分布的比较见表1。CI组和正常对照组间ACE基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（P>0.05）。表1  两组ACE基因型及等位基因频率分布的比较    2.2  两组AT1R基因型及等位基因频率分布的比较见表2。  CI组中AC基因型频率为31.8%，C等位基因频率为15.9%，明显高于正常对照组（11.1%，5.6%）（均P＜0.05）。表2  两组AT1R基因型与等位基因频率的比 注：与正常对照组比较*P＜0.05    2.3  入组者ACE 基因型和AT1R 基因型CI患病风险分析  见表3。与AT1R AA基因型相比，入组者AT1R AC基因型CI患病风险OR为3.733(95%CI：1.684～8.270)（P＜0.001）；同时携带AT1R AC基因型和ACE DD基因型个体CI患病风险OR为4.070(95%CI：1.430～11.582)（P＜0.01）；同时携带有AT1R AC基因型和ACE基因ID型个体CI患病风险OR为2.057(95%CI：0.891～4.751)。表3  ACE及AT1R 基因型CI患病风险的分析变量回归系数3  讨  论    肾素血管紧张素系统（RAS）是调节血压、维持体内水、电解质平衡的重要因素。ACE是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)形成过程中的一个重要的限速酶，它主要受控于ACE基因。ACE基因具有插入/缺失（I/D）的多态性；既人群中有3种基因型：长度为490 bp II纯合型，490/190 bp ID杂合型和190 bp DD纯合型。由于ACE基因型不同而致个体间循环中ACE水平的差异，将对AngⅡ形成和缓激肽的灭活产生作用，继而影响机体的水钠平衡、醛固酮的分泌、血管收缩和血管平滑肌细胞增殖，而这些均是导致CI的关键因素。AT1R是G蛋白偶联受体，主要分布在血管平滑肌和心脏，被AngⅡ激活后的效应主要为对血压和水电解质平衡的影响，高血压可致心血管系统形态学和功能上的改变，如左室重塑、心肾纤维化、血管形态和舒缩性质的改变、内皮功能的损害等。AT1R基因位于人类3号染色体长臂21～25区， A1166C位于3′未翻译区的5′端，A突变为C产生3种基因型：未突变纯合子AA型，酶切后仅有360 bp片段一条带；突变杂合子AC型，酶切后有360 bp、220 bp、140 bp片段3条带；突变纯合子CC型，酶切后有220 bp、140 bp片段两条带。该位点突变不导致其编码氨基酸序列及功能的改变，但可能参与转录与翻译的调控，从而影响AT1R的生理学作用［8］。    本研究未发现，ACE基因型和等位基因频率分布在CI组和正常对照组间有差异，提示ACE基因I/D多态性不影响CI的发病；而在CI患者中AT1R 的AC基因型及C等位基因频率明显高于正常对照组，提示AT1R AC基因型与CI的发生有密切的关系。同时，两组AT1R AC基因型的个体患CI的危险度比AA基因型高3.733倍，而在同时携带有AT1R AC基因型和ACE DD基因型的个体患CI的危险度增加至4.070。提示AT1R 基因A1166C多态性与ACE基因I/D多态性间协同对CI的发生、发展产生影响。由于基因变异对遗传表型的作用同时受环境因素的影响，而ACE基因多态性与AT1R基因多态性产生的微小表型效应积累与环境的协同作用使其在CI发生、发展过程中的作用更趋复杂。    目前针对一些传统危险因素的控制以预防CI；对CI分子遗传学的危险因素的识别将对CI的预防和治疗产生更广泛的影响。通过对CI高危基因的筛查，将有可能更为全面地判定CI发生的高危人群，从而可采取有针对性的预防和治疗措施，有效预防CI的发生和控制其进展。【参考文献】  ［1］和姬苓，王永福，王颖慧，等.血管紧张素转换酶基因多态性与脑血管病的关系［J］.临床神经病学杂志，2004,17:406.  ［2］Kagiyama T, Kagiyama S, Phillips MI，et al. Expression of angiotensin type 1 and 2 receptors in brain after transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Regul Pept, 2003,110:241.  ［3］Zhong Y, Ha D. Influence of angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene polymorphism on patients with essential hypertension complicated by brain infarction［J］. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2002,19:201.  ［4］Rubattu S, Di Angelantonio E, Stanzione R, et al. Gene polymorphisms of the reninangiotensinaldosterone system and the risk of ischemic stroke: a role of the A1166C/AT1 gene variant［J］. Hypertens, 2004,22:2129.  ［5］和姬苓，王永福，杨国安，等.血管紧张素Ⅱ受体1基因多态性与脑血管病的关系［J］.临床神经病学杂志，2007,20:12.  ［6］Rinat B, Hubert C, Corvol P, et al. PCR detection of the insertion/ deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene［J］.Nucl Acids Res,1990, 20:1433.  ［7］张秀英，王德全，许玲，等.肾素血管紧张素系统基因多态性与2型糖尿病脑梗塞的关系［J］.中华医学遗传学杂志，2001,18:462.  ［8］Rolfs A,Weber RL, Regitz ZV, et al. Genetic polymorphism of the angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) receptor gene［J］. Bur Heart J,1994,15:108.