COX2、PCNA及p53在鼻咽癌中的表达及意义

　　作者：苗北平 作者单位：深圳市第二人民医院耳鼻咽喉-头颈外科， 广东 深圳 518035

　　【摘要】 研究COX2、PCNA及p53的基因产物在鼻咽癌组织中的表达及与其生物学行为和生存率之间的关系。方法:采用免疫组化SP法检测60例鼻咽癌及30例正常鼻咽组织中COX2、PCNA 及p53的蛋白表达水平。结果:(1) 鼻咽癌组织COX2、PCNA 及p53阳性表达率分别为90%、75%和68% ,明显高于正常鼻咽组织;(2) 鼻咽癌组织COX2、PCNA及p53的表达与临床分期、分化程度和淋巴结转移相关(P<0.05);(3) COX2、PCNA及p53的表达密切相关;(4) 鼻咽癌组织COX2、PCNA 阳性表达和生存率呈负相关，是鼻咽癌复发的显著预后因素。结论:鼻咽癌组织中COX2、PCNA表达水平明显上调，与鼻咽癌的发生发展及预后不良有关,免疫组化检测COX2、PCNA表达可用以判断鼻咽癌患者的预后。

　　【关键词】 环氧合酶2 增殖细胞核抗原 蛋白 p53 鼻咽癌 免疫组化 预后

　　MIAO Beiping1, LU Yongtian1, XU Anting2

　　(Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, 1. Shenzhen Second People′s Hospital,

　　Shenzhen 518035, Guangdong， China; 2. Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong， China)

　　[ABSTRACT] Objective: To ascertain the possible roles of COX2，PCNA and p53 in the tumorigenesis and development of nasopharyngeal carcinoma, and to evalulate their impact on the prognosis of nasopharyngeal carcinoma. Methods: Immunohistochemical assay was used to determine COX2, PCNA and p53 in all specimens, including 60 cases of nasopharyngeal carcinoma and 30 cases of normal nasopharynx. Results: (1) The overall positive expression rate of COX2， PCNA and p53 in nasopharyngeal carcinoma was 90%, 75% and 68% respectively, higher than that in the normal nasopharynx. (2) Intensity of expression of COX2, PCNA and p53 in nasopharyngeal carcinoma was related to tumor stage, tumor differentiation and lymph node metastasis (P<0.05). (3) Expressions of COX2, PCNA and p53 were correlated with each other in nasopharyngeal carcinoma. (4) Positive COX2 and PCNA were associated with a lower 5year survival and they were significant prognostic variables for recurrence(P<0.05). Conclusion: COX2, PCNA and p53 may play vital roles in the tumorigenesis and development of the cancer via different methods. Unfavorable prognosis was associated with expression of COX2 and PCNA while not with p53. Immunohistochemical assessment of COX2 and PCNA might be a useful molecular marker for predicting prognosis in nasopharyngeal cancer.

　　[KEY WORDS] Cyclooxygenase2; Proliferating cell nuclear antigen; Protein, p53; Nasopharyngeal carcinoma; Immunohistochemistry; Prognosis环氧合酶2 (cyclooxygenase2, COX2)在除胎盘、肾和脑组织外绝大多数正常组织表达阴性，近年发现它可能抑制细胞凋亡而导致肿瘤。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA )是DNA 聚合酶δ的辅助蛋白,与细胞增殖密切相关,可作为评价细胞增殖状态、反映细胞增殖动力学的指标。我们用免疫组化方法对COX2、PCNA和p53在鼻咽癌组织中的表达与生物学特性、生存率的关系进行了研究。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本 深圳市第二人民医院耳鼻咽喉科1999年1月至2001年1月收治的60例鼻咽癌患者， 26 60岁,平均(42.3±5.5)岁。入选条件：病理诊断为鳞状细胞癌,放射治疗前活检标本完好,完成全程根治性放射治疗,随访5年以上,病历资料完整。活检标本为常规石蜡包埋，按1992年全国NPC 福州会议推荐的临床分期标准,Ⅰ期6例, Ⅱ期19 例, Ⅲ期22例, Ⅳ期13例;38例伴有淋巴结转移;病理分级：高分化11例, 中分化18例, 低分化31例。30例对照为活检时钳取之正常鼻咽部组织。

　　1.2 免疫组化试验方法 抗COX2、PCNA及p53单克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品;二抗为EnVision HRP标记的羊抗鼠IgG(即用型),均为美国Santa Cruz公司产品。免疫组化染色程序严格按SP试剂盒说明书进行，一抗稀释度均为1∶100，DAB 显色,苏木精复染,光镜下观察。

　　1.3 结果判断 每批染色均设立对照,以PBS液代替一抗为阴性对照，COX2以胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。PCNA 及p53均以细胞核内棕黄色颗粒为阳性(图1、2)。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS11.5进行统计学处理。各组之间率的比较采用χ2检验; COX2、PCNA及p53表达之间的相关性采用相关系数r表示;生存率用KaplanMeier法计算，COX2、PCNA及p53与生存率的关系用Logrank检验分析。

　　2 结 果

　　2.1 鼻咽组织中COX2、PCNA及p53的表达 60例鼻咽癌组织中COX2阳性表达54例,阳性率为90%;PCNA阳性表达45例,阳性率为75%;p53阳性表达41例,阳性率为68%。三者的表达明显高于正常鼻咽部组织(P<0.05)，见表1。

　　2.2 鼻咽癌组织COX2、PCNA及p53的表达 其水平均随着临床分期的升高而升高，并且均在分化程度低的鼻咽癌组织中高表达，差别有统计学意义(P<0.05);伴有淋巴结转移的鼻咽癌组织均高表达上述蛋白，与不伴有淋巴结转移的鼻咽癌相比差别有统计学意义(P<0.05)，见表1。

　　2.3 鼻咽癌组织中COX2、PCNA及p53的表达 三种成分的表达具有相关性(P<0.05)，见表2。

　　2.4 COX2与PCNA的阳性表达与鼻咽癌预后的关系 所有患者均给予根治性放疗，放疗结束出院1年内每3月随访1次,放疗后1 3年内每半年随访1次,3年以上每年随访1次。随访内容及方式: VCAIgA实验室检查、纤维鼻咽喉镜及内镜检查、CT检查、B超及X光平片检查。3例失访,失访者自失访之日起按死亡计算。平均随访5.5年。COX2与PCNA阳性表达的鼻咽癌患者相对于阴性表达者总生存率降低(P<0.05),而p53表达与无瘤生存时间和总生存率无相关性。COX2 与PCNA的阳性表达是肿瘤的预后因素，见表3。

　　3 讨 论

　　COX2是一种膜结合的分子量为71?ku的糖蛋白，具有环氧合酶和过氧化物合成酶的双重功能。COX2是前列腺素生成过程中的重要限速酶，于1991年由Xie等[1]首次发现。COX2在正常组织中不表达或极微量表达，但在肿瘤组织中表达量显著提高，提示与肿瘤的发生密切相关。

　　COX2参与肿瘤发生的机理未明,可能是:(1) 促进瘤血管生成;(2) 上皮生长因子受体信号通路的ras和丝裂原激活蛋白激酶B等关键步骤调节障碍导致COX2过表达[2];(3)　COX2的过表达促进bcl2升高，bcl2/bax比率增大改变了bcl2与bax之间的平衡从而抑制凋亡[3];(4) 增加肿瘤细胞侵袭、转移的潜能;(5) 抑制机体免疫反应等。

　　本研究发现，COX2在鼻咽癌组织中强阳性表达，并且与肿瘤的分级、分期及淋巴结转移及生存率相关。提示COX2的过表达不仅促进鼻咽癌的发生，并且可能加强了肿瘤的侵袭和转移能力，我们的研究结果与Lim等[4]的发现相符。Peng等[5]和Cornetta等[6]在对喉鳞癌和甲状腺癌的研究中也发现COX2 mRNA和COX2蛋白的高表达。Gallo等[7]的研究表明，在头颈部肿瘤中COX2的表达与肿瘤的血管生成有密切联系，同时通过Cox多元回归分析发现,COX2蛋白的过表达是最有意义的预后因子。

　　Miyachi等于1978年首次发现增殖细胞核抗原。PCNA为酸性核内蛋白质,含有261个氨基酸,分子量为36?kD,PCNA是DNA多聚酶δ的辅助蛋白,也是一种细胞周期调控蛋白，作用是调节DNA多聚酶的活性。其含量随细胞增殖周期的不同而变化,G周期开始增加,S期达高峰,G2、M期又持续下降,至G0期维持在最低水平，其变化和DNA合成一致。在G1/S转换期,PCNA发生磷酸化,再与DNA结合部位结合,激活DNA复制因子,促使细胞增殖。PCNA和周期素依赖性激酶共同参与细胞周期的调控和DNA 的合成,DNA的合成是细胞分裂增殖的必要条件,因此PCNA与细胞增殖有密切的关系,可作为评价细胞增殖状态、反映细胞增殖动力学的指标。细胞周期失控是细胞癌变的重要原因,增殖系统的成分过表达与抑制增殖系统成分的低表达和缺失都会使细胞增殖失控,导致细胞癌变。具有抑制增殖系统功能的成分有p53等,具有促进增殖系统的成分有PCNA周期素等 。

　　本研究发现，PCNA在鼻咽癌中高表达，与肿瘤的分级、分期及淋巴结转移相关，并且PCNA高表达患者的5年生存率明显低于阴性表达者(P<0.05)。Sarac等[8]报道PCNA和喉癌的病理分级、淋巴血管侵袭、肿瘤边缘厚度、颈部淋巴结转移、局部区域复发等均有明显相关性,PCNA 在有隐匿性淋巴转移喉癌中的表达明显高于无淋巴转移者,并且是估计预后的有用指标。Tsai等[9]报道，PCNA和鼻咽癌患者的局部复发有明显相关性。Morawski等[10]报道,喉癌PCNA 表达与病理分级有明显相关性。Dobros等[11]报道，晚期喉癌PCNA 的高表达和生存率及淋巴结转移均有统计学关联。

　　p53基因和头颈等肿瘤的组织分化、淋巴转移、临床预后的关系有许多报道,Kazkayasi等[12]研究报告,p53在喉癌的表达率为74%,p53过表达和年龄、位置、临床分期、组织病理分级、临床预后均无关系,但和淋巴结转移有明显相关性。而Sarkar等[13]报道,p53 蛋白过表达和喉癌的病理分级和临床分期有密切相关性。Garozzo等[14]报道，p53 和喉癌的病理分级有明显相关。本研究显示，p53蛋白过表达与鼻咽癌病理学分级、临床分期及淋巴结转移密切相关，但和生存率无明显相关性，其机理有待于进一步研究。

　　本研究结果显示，COX2、PCNA及 p53的表达有相关性。可能因为野生型 p53能抑制PCNA及PCNA激酶的活性，导致细胞循环停滞于G1S期以待DNA修复，这种情况下伴有PCNA表达的下降 ,但p53突变后便干扰这种抑制能力，并促进细胞增殖，从而肿瘤细胞显示出很高的增殖活性，并且伴有PCNA的高表达。野生型p53基因的产物也可抑制COX2表达，p53基因突变的细胞失去了这种抑制，导致COX2高表达。COX2的过表达导致bcl2/bax比率增大，改变了bcl2与bax之间的平衡从而抑制凋亡[3]，PCNA的高表达也导致凋亡抑制。我们推测，COX2、PCNA的高表达有协同作用，在早期促使细胞的恶性转化。

　　本研究表明，COX2、PCNA及p53阳性表达与鼻咽癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移密切相关;COX2、PCNA的阳性表达与鼻咽癌患者的生存率呈负相关。免疫组化检测鼻咽癌组织中COX2、PCNA的表达可用作预测鼻咽癌患者预后的一个有用指标。p53的基因突变导致了COX2、PCNA高表达,所以可以通过修复野生型p53基因或其他措施抑制COX2、PCNA的表达,进而抑制肿瘤的发展。

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