鼻息肉上皮细胞增殖活性和凋亡活性的比较

    作者：林心强    作者单位：汕头大学医学院第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科, 广东 汕头 515041     【关键词】  鼻息肉 上皮细胞 增殖 凋亡

    LIN Xingqiang, WANG Huige, SHEN Zhizhong, ZHANG Yan， YE Huijie， YANG Danna

    (Department of Otorhinolarnygology & Head and Neck Surgery, First Affiliated Hospital of

    Medical College of Shantou University, Shantou 515041, Guangdong, China)

    Abstract: Objective   To investigate the status of the balance between proliferation and apoptosis of epithelial cells in nasal polyps and to explore its pathogenic significance. Methods   Expressions of PCNA were determined for 29 cases of nasal polyps in the treatment group and 11 cases of normal inferior turbinates in the control group by immunohistochemical staining. The apoptosis cells in site were determined by the TUNEL technique.  Results   ① Both the  PCNA positive index（PIPCNA）and the apoptosis index（AI）of epithelial cells in nasal polyps were prominently higher  than those in normal inferior turbinates（30.02±5.89, 5.33±2.79, respectively）(P＜0.01). However, the  PIPCNA/AI ratio of epithelial cells in nasal polyps（1.95±0.66） was lower than that in normal inferior turbinates（6.93±3.32）(P＜0.01).② The PIPCNA  of epithelial cells in nasal polyps (53.60±11.10) was prominently higher than the AI of epithelial cells in nasal polyps（29.48±8.20）(P＜0.01). Conclusions   Both proliferation actability and apoptosis actability of epithelial cells in nasal polyps are increasing, and the latter is of a large increasing range, but the proliferation rate of epithelial cells in nasal polyps, taking one with another, is still higher than the apoptosis rate, resulting in an increasing cell accumulation accompanied by overproliferation of epithelial cells in nasal polyps.

    Key words: Nasal polyps； Epithelial cells； Proliferation；Apoptosis

    鼻息肉的病理学特征是间质水肿、炎性细胞浸润、腺体形成和上皮细胞过度增殖。鼻息肉的发病机制尚不明确。近年来有学者［14］研究发现，在长期多种病理因素的刺激下，鼻息肉上皮细胞增殖和凋亡平衡失调及分化异常，在鼻息肉的最初形成、体积的不断增大、新腺体的形成和黏膜炎症反应过程中发挥着重要作用。本研究中我们采用免疫组化染色法检测PCNA基因蛋白在鼻息肉上皮细胞中的表达，采用TUNEL过氧化酶原位标记法检测鼻息肉上皮细胞的凋亡，旨在比较鼻息肉上皮细胞的增殖活性和凋亡活性，进一步探讨鼻息肉上皮细胞增殖和凋亡平衡失调的发病学意义。

    1  材料与方法

    1.1  实验对象  收集鼻内镜手术切除的鼻息肉标本（实验组）29例，男18例，女11例，9 71岁，平均39岁。鼻中隔矫正术切除的正常下鼻甲标本（对照组）11例，男9例，女2例，14 62岁，平均32岁。

    1.2  切片制备  每例标本离体后以10%中性福尔马林固定，48?h内石蜡包埋，4?μm连续厚切片，贴于涂有明胶的载玻片上，58?℃烤干1?h，置4?℃冰箱中备用。

    1.3  实验试剂  即用型免疫组化二步法ElivisionTM染色试剂盒［ElivisionTM twostep (Mouse) kit(kit 9801)］和DAB显色盒（DAB0031）均购自福州迈新生物技术开发公司。原位杂交细胞凋亡检测试剂盒［In situ cell death detection kit, POD(Cat.No.1684817)］和去核酸酶蛋白K(Cat.No.745723)购自德国Roche Molecular Biochemicals公司。PCNA一抗见表1。编号克隆号同型物稀释度供应商PCNA鼠抗人单克隆抗体MAB0145PC10IgG2a/k即用型Maxim Biotech

    1.4  免疫组化（ElivisionTM二步法）  按ElivisionTM二步法试剂盒说明行免疫组化染色，观察PCNA蛋白的表达。PCNA一抗采用鼠抗人单克隆抗体。显色剂采用DAB溶液。PBS代替一抗，其他操作步骤相同，作为阴性对照。

    结果判断： PCNA 阳性细胞细胞核呈棕黄色或棕褐色。随机选取5个含上皮细胞的高倍视野（×400），计数上皮细胞数和PCNA阳性上皮细胞数，计算阳性指数（PI=阳性上皮细胞总数/上皮细胞总数）。

    1.5  TUNEL过氧化酶原位标记法  按TUNEL过氧化酶原位标记试剂盒说明行原位杂交，观察细胞凋亡。蛋白酶K工作液、TUNEL反应液（酶溶液+标记溶液）和DAB显色液均新鲜配制；荧光标记的POD转化液为即用型。标记溶液代替TUNEL反应液,其他操作步骤相同，作为阴性对照。

    结果判断：凋亡细胞细胞核呈棕黄色或棕褐色。随机选取5个含上皮细胞的高倍视野（×400），计数上皮细胞数和凋亡上皮细胞数，计算凋亡细胞指数（AI=凋亡上皮细胞总数/上皮细胞总数）。

    1.6  统计学处理  采用SPSS10.0 for windoms统计软件包对实验数据进行贮存和处理。采用两独立标本t检验比较实验组和对照组PIPCNA和AI的统计学差异。采用单标本t检验比较实验组PIPCNA和AI的统计学差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  上皮细胞PCNA基因蛋白的表达  11例正常鼻黏膜上皮PCNA阳性细胞仅分布于基底层，未见于表皮层。29例鼻息肉上皮PCNA阳性细胞大多数分布于基底层呈棕褐色，少数分布于表皮层呈棕黄色，从内向外递减（彩图11）；1例鼻息肉上皮下微腺体形成，微腺体PCNA阳性细胞多见，与上皮PCNA阳性细胞呈连续渐变的显微解剖学关系（彩图12）；1例鼻息肉上皮呈局部内翻性乳头状瘤样改变（彩图13）。

    2.2  上皮细胞TUNEL原位细胞凋亡检测结果  11例正常鼻黏膜上皮凋亡细胞仅见于基底层，未见于表皮层；29例鼻息肉上皮凋亡细胞大多数分布于基底层，少数分布于表皮层（彩图14）。

    2.3  上皮细胞PIPCNA和AI（±s）的比较  见表2。

    3  讨  论

    所有多细胞有机体都存在细胞增殖和细胞凋亡的动态平衡，构成控制细胞群体大小的“阴阳”调节环，对多细胞有机体稳态的维持、正常生理功能的发挥和疾病的转归有十分重要的意义［5］。如果细胞增殖过多或凋亡减少，就会导致细胞过剩性疾病，相反，如果细胞增殖过少或细胞凋亡增加，就会导致细胞减少性疾病。

    反映细胞增殖活性最直接的指标是细胞周期进行速度，细胞周期进行速度与细胞周期时间成反比，测定了细胞周期时间，就能直接测定细胞的增殖活性。由于临床实验无法测定细胞周期时间，因而无法直接测定细胞的增殖活性，目前用于评价细胞增殖活性的各种方法都是测定周期细胞的比例，间接地反映细胞的增殖活性：（1）利用普通光学显微镜，直接记录核分裂细胞，计算分裂指数（mitotic index, MI）；（2）应用增殖标记物（3HTdR、BrdU、PCNA、Ki67和AgNOR）检测周期细胞；（3）通过DNA流式细胞术测定2c4c细胞比例，估算S期分数。其中PCNA是一种36?kD非组蛋白核内蛋白质，是DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε的附属蛋白，在DNA合成和修复过程中发挥关键性作用［67］。G0G1期细胞没有明显PCNA表达，G1晚期PCNA表达大幅度增加，S期达到高峰，G2期开始下降，M期很低，因此，PCNA是评价细胞增殖状态的一个重要的指标［68］。

    细胞染色质DNA的特征性降解是细胞凋亡一个显著的生化特征，是确证细胞凋亡一个重要的实验判断依据，被广泛应用于细胞凋亡的鉴定。凋亡细胞染色质DNA的降解过程具有特征性［9］：（1）染色质DNA降解发生于细胞形态学改变之前，是细胞凋亡的早期事件，是内源性核酸内切酶（DNA酶）活化和表达的结果；（2）染色质DNA的片断化是有规律的，均为180 200?bp的整数倍，因此进行琼脂糖凝胶电泳时，可见特征性的梯形带（ladder like pattern）；（3）染色质DNA的断裂，大部分为单链断裂。内源性核酸内切酶仅在一个位置上切断单链，极少在同一位置上同时切断双链；（4）染色质DNA断裂的位置，大部分位于核小体间的连接区，形成一系列散布于核小体间的单链切口。这是ISEL和TUNEL的理论依据；（5）染色质DNA片断被胞膜包裹，形成凋亡小体，用吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）双染色，在荧光显微镜下清晰可辨。TUNEL过氧化酶标记法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，能对凋亡细胞进行原位染色，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、测定培养细胞和组织分离细胞的凋亡。在适合底物的存在下，过氧化物酶能产生很强的颜色反应，其特异性和敏感性远比一般组织化学和生物化学测定法高，并可在普通光学显微镜下进行观察，方便快捷，被广泛应用于细胞凋亡的研究［10］。

    本研究结果显示：（1）鼻息肉上皮细胞PIPCNA和AI均大于下鼻甲上皮细胞PIPCNA和AI（P＜0.01），表明鼻息肉上皮细胞增殖活性和凋亡活性均增强，这可能是机体组织在病理刺激条件下的一种自身平衡效应［1］；（2）鼻息肉上皮细胞PIPCNA/AI小于下鼻甲上皮细胞PIPCNA/AI(P＜0.01)，表明鼻息肉上皮细胞增殖活性和凋亡活性虽均增强，但增强的幅度不均衡，凋亡活性增强幅度较大；（3）鼻息肉上皮细胞PIPCNA大于AI(P＜0.01)，说明鼻息肉上皮细胞增殖活性大于凋亡活性，这是因为虽然鼻息肉上皮细胞PIPCNA均数是下鼻甲上皮细胞PIPCNA均数的1.79倍，鼻息肉上皮细胞AI均数是下鼻甲上皮细胞AI均数的5.53倍，但是，由于下鼻甲上皮细胞PIPCNA均数远大于AI均数，约6.93倍，因此，总体而言，鼻息肉上皮细胞增殖率仍然大于细胞死亡率。根据细胞累积率=细胞增殖率-细胞死亡率［17］，鼻息肉上皮细胞累积率=53.60%-29.48%=24.12%，细胞累积增多，结果导致了鼻息肉上皮细胞过度增殖现象［1113］；（4）鼻息肉上皮PCNA阳性细胞和凋亡细胞两者的定位都是大多数位于基底层，少数位于表皮层，呈现鼻息肉上皮增殖细胞和凋亡细胞从基底层向表皮层递减分布的一致性，这种增殖细胞和凋亡细胞从基底层向表皮层递减分布的一致性体现了从基底层未成熟细胞向表皮层成熟细胞分化发育过程中增殖活性和凋亡活性的一致性，这是机体组织自身平衡效应的另一种表现；（5）两个宝贵的发现：一个是鼻息肉上皮下微腺体形成，微腺体PCNA阳性细胞多见，与上皮PCNA阳性细胞呈连续渐变的显微解剖学关系，这是鼻息肉上皮基底细胞过度增殖、异常分化形成间质新腺体的有力证据。另一个是鼻息肉上皮局部有内翻性乳头状瘤样改变，提示鼻息肉可能转化为鼻腔内翻性乳头状瘤，但机制尚不明确，可能也与过度增殖的鼻息肉上皮基底细胞异常分化有关。

【参考文献】［1］ 董震，关桂梅，常万龙. 鼻息肉组织中细胞增殖与凋亡相关基因蛋白的表达意义［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35（6）：429431.

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［12］ Coste A, Wang Q P, Roudotthoraval F, et al. Epithelial cell proliferation in nasal polyps could be upregurated by plateletderived growth factor ［J］. Laryngoscope, 1996, 106(5 Pt 1): 578583.

［13］ 左成昌，张志钢，郑秀玲，等.上皮细胞增殖在鼻息肉发病机理中的意义［J］.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志, 2001, 9（3）：116118.