p21、p73及PTEN在头颈部多原发癌中的表达及意义

    作者：黄方    作者单位：福建医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科， 福建 泉州 362000     【摘要】  目的 探讨p21、p73与PTEN在头颈部多原发癌组织中的表达与意义。方法 采用免疫组织化学方法对30例头颈部多原发癌患者的42份标本、42例头颈部单发癌及30例来源于头颈部的正常上皮组织标本中p21、p73与PTEN蛋白表达进行检测，并将检测结果作统计学分析。结果 p21、p73与PTEN蛋白在头颈部多原发癌组织中阳性表达率分别为69.05％、57.14％和71.43％；在单原发癌组阳性表达率分别为76.19％、40.48％和76.19％；在正常上皮组织中阳性表达率分别为96.66％、13.33％和100.00％。在多原发癌及单发癌组织中p21与PTEN蛋白失表达率以及p73蛋白过表达率均显著高于正常上皮组织（P＜0.05）；三个指标在多原发癌与单发癌组织中的表达差异均无统计学意义。结论 p21与PTEN蛋白失表达以及p73蛋白表达上调，参与头颈部多原发癌和单发癌的形成机制，但还不能认为其在头颈部多原发癌与单发癌形成中的作用有差别。

    【关键词】  多原发癌 头颈部肿瘤 p21 p73 PTEN 免疫组织化学

    Abstract: Objective   To investigate the effects of p21, p73 and PTEN expressions in multiple primary cancers of the head  and neck. Method   Expressions of p21, p73 and PTEN were determined by the SP immunohistochemical technique in 42 samples of multiple primary cancer tissues, 42 cases of marched single cancer tissues of the head and neck, and 30 cases of normal epithelial tissues of the head and neck. Results   Positive expression rates of p21, p73 and PTEN in multiple primary cancer tissues and single cancer tissues of the head and neck were 69.05％, 57.14％, 71.43％ and 76.19％, 40.48％, 76.19％, respectively, and those in normal epithelial tissues were 96.66％, 13.33％ and 100.00％. The loss expression rates of p21 and PTEN and the overexpression rates of p73 in multiple primary cancer tissues and single cancer tissues of the head and neck were all significantly higher than those in normal epithelial tissues(P＜0.05), but no significant differences were found between multiple primary cancer tissues and single cancer tissues. Conclusion   The loss of expression of p21 and PTEN and the upregulated expression of p73 may play important roles in tumor genesis of multiple primary cancer and single cancer of the head and neck, but no differences have been found till now between multiple primary cancer and single cancer.

    Key words: Multiple primary cancers; Head and neck neoplasms; p21; p73; PTEN; Immunohistochemistry

    多原发癌是指机体同时或相继发生两个或两个以上彼此无关系的癌肿。头颈部多原发癌患者日趋增多，已成为影响头颈部肿瘤患者5年生存率重要因素之一。有研究表明，肿瘤的形成是一个多因素、多步骤的包含多个癌基因和抑癌基因参与的累积和协同的分子事件，原癌基因激活和抑癌基因失活及细胞内信号传导紊乱被认为是肿瘤发生发展的基础。目前国内有关头颈部多原发癌的研究还局限在对肿瘤的临床和细胞病理学分析上，国外学者对头颈部多原发癌发生发展的分子机制研究也主要集中在p53和cyclinD等少数目标基因上，尚未能找到明确的公认的致病因素,而p21、p73及PTEN基因突变和/或表达异常与多种肿瘤的发生发展相关。我们收集近年来30例头颈部多原发癌患者的42份石腊标本，并设立头颈部单发癌和正常上皮源性组织作为对照，采用免疫组织化学方法检测p21、p73及PTEN在头颈部多原发癌的表达情况，旨在探讨p21、p73及PTEN在头颈部多原发癌发病中的作用，报告如下。

    1  资料与方法

    1.1  标本

    1.1.1  实验组  收集福建医科大学第二临床医学院1992 2004年间，30例确诊为头颈部多原发癌患者的病理活检、或手术切除的癌组织石蜡包埋标本30例，经筛选剔除肿瘤发生部位不在头颈部的先证癌或第二癌组织标本，以及非上皮源性的肿瘤组织标本后，入选标本42份。发病部位：喉部11份，下咽4份，鼻咽2份，鼻窦5份，腭部2份，舌8份，颊部3份，甲状腺2份，食管2份，腮腺、鼻背皮肤及鳃裂囊肿恶变各1份。42份标本中鳞状细胞癌38份，腺癌4份。多原发癌的诊断采用Warren与Gates推荐的标准：（1）每种肿瘤须有组织学检查确定为恶性；（2）每种肿瘤需有正常组织间隔；（3）排除一种肿瘤为另一种肿瘤的转移灶。同时结合参考文献［1］,癌的诊断包括不同组织病理类型或满足以下条件：（1）两种肿瘤都局限在原发部位；（2）肿瘤间无直接连接；（3）无远处转移；（4）异时癌如果缺乏具有决定性的组织病理学上差异，第二癌与先征癌必须有2?cm或2?cm以上的正常组织间隔，或发生在3年及3年以后。

    1.1.2  对照组  （1）收集福建医科大学第二临床医学院1997 2001年间确诊的头颈部单发癌癌组织石蜡包埋标本42例。入选条件为随访至少3年以上无肿瘤复发或患第二原发癌，并与实验组的肿瘤病理类型、分化程度、发生部位及TNM分期匹配；（2）随机收集2000 2001年间福建医科大学第二临床医学院确诊的头颈部良性上皮组织石蜡包埋标本30例。

    1.2  主要试剂  鼠抗人p21单克隆抗体（工作液）、鼠抗人p73单克隆抗体（浓缩液）、鼠抗人PTEN单克隆抗体（浓缩液）、即用型SP试剂盒及DAB显色试剂盒。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

    1.3  免疫组织化学检测  检测步骤按SP试剂盒说明书进行。每一标本作4?μm厚切片4张，1张作HE染色，另3张分别行p21、p73及PTEN蛋白免疫组化染色。另选已知的阳性组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。阳性细胞染色为胞核或胞浆棕黄色着色。阳性细胞计数：先在低倍镜下选取有代表性视野再在高倍镜下计数，每例计数4个高倍视野至少200个细胞，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率。结果判断：阳性细胞数≤5%为阴性（-），阳性细胞数＞5％为阳性（＋）。

    1.4  统计学处理  各组间表达率的差异采用χ2检验，Ｐ＜0.05为差异有统计学意义，利用SPSS 11.0统计软件处理。

    2  结  果

    2.1  p21在三种组织中的表达情况  p21在头颈部多原发癌和单发癌的癌组织以及正常上皮组织中的阳性表达定位于细胞核，呈黄色至棕黄色颗粒状着色；阳性细胞呈巢状或散在分布（彩图3）。头颈部多原发癌及单发癌的癌组织中p21阳性表达率明显低于正常上皮组织，其差异有统计学意义，而多原发癌与单发癌间无统计学意义（表1）。

    ① 多原发癌与单发癌； ② 单发癌与正常上皮；     ③ 多原发癌与正常上皮比较2.2  p73在三种组织中的表达情况  p73在头颈部多原发癌和单发癌的癌组织及正常上皮组织中的阳性表达也定位于细胞核（彩图4）。多原发癌及单发癌的癌组织中阳性p73表达率明显高于正常上皮组织，其差异有统计学意义；而在多原发癌与单发癌间差异无统计学意义（表2）。   阳性   阴性    阳性率（％）χ2值       P值多原发癌

    ① 多原发癌与单发癌；      ② 单发癌与正常上皮；     ③ 多原发癌与正常上皮比较

    2.3  PTEN 的表达情况  PTEN在头颈部多原发癌和单发癌的癌组织及正常上皮组织中的阳性表达主要定位于细胞核，少数细胞定位于细胞质，呈黄色至棕黄色颗粒状着色（彩图5）。头颈部多原发癌及单发癌的癌组织中PTEN阳性表达率明显低于正常上皮组织，其差异有统计学意义；而在多原发癌与单发癌间差异无统计学意义（表3）。   阳性   阴性    阳性率（％）χ2值       P值多原发癌    42    30     12           ＞0.05单原发癌    42    32     10              ＜0.05正常上皮    30    30        100.00         10.285③    ＜0.01

    ①多原发癌与单发癌；②单发癌与上皮组织；③多原发癌与上皮组织比较

    3  讨  论

    3.1  p21、p73及PTEN的结构和生物学功能  p21基因是1993年发现的一种肿瘤抑制基因，定位于6p21.2，编码一个由164个氨基酸组成蛋白质，体外翻译产物为21KD。正常细胞中，P21蛋白与细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase，CDK）、细胞周期蛋白（cyclin）及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）以四聚体形式存在。低浓度的P21蛋白作为CDK的聚集因子，正性调节CDK功能而推动细胞周期进程，促进G1期向S期转化，但高水平表达的P21蛋白与cyclin竞争性地与CDK结合而抑制该激酶活性，使细胞周期停滞于G1期而不进人S期，从而抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡。国内外文献对p21在多种头颈部肿瘤细胞中表达情况均有报道，王敏等［2］实验结果显示p21在不同类型鼻咽癌中有不同程度的表达下调或不表达，随着鼻咽癌分化程度的下降, p21愈倾向于弱表达或不表达。Jeannon等［3］研究表明，p21在喉癌组织中阳性表达率增高，则患者的5年生存率下降，认为p21的阳性表达率可作为判断喉癌患者预后指标之一。以上研究显示p21失表达或低表达与头颈部多种肿瘤的发生发展相关。

    p73基因是1997年发现的p53家族新成员，定位于1p36.3, 编码产物是相对分子量为73?KD的P73蛋白。Fontemaggi等［4］的研究分析了p73和p53激活后H1299细胞的基因表达,结果显示P73和P53蛋白激活共同的和不同的基因，证实P73和P53蛋白在靶基因结合方面具有同源性，但二者的功能具有很大的差异。p73和p53之间可能存在某种相互作用，野生型P53表达水平下降，p73表达水平增高。p73基因在肿瘤细胞中很少突变，在正常组织是单等位基因表达［5］，而在多数肿瘤细胞如胃癌、膀胱癌呈双等位基因表达，蛋白表达较正常组织显著增高［6，7］。p73从其能诱导细胞周期阻滞和凋亡的功能来看，具有一定的抑制肿瘤功能，但其在肿瘤中的表达状态又不支持其“抑癌基因”的作用。p73的确切功能还有待于进一步研究。

    PTEN是1997年发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于10q23.3，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，约55?kD。PTEN在多种正常组织中高表达。PTEN基因失活可表现为突变和/或丢失、PTEN蛋白表达降低甚至不表达，其失活与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关［811］。在PTEN与p53抑癌机制关系上，Mayo等认为PTEN通过抑制PIP3Akt信号传导通路而增加p53的表达［12］。Mao等通过研究放射线诱发的裸鼠淋巴瘤的基因表达情况，认为p53和PTEN在功能上是相关的，PTEN能保护P53蛋白不被降解，而P53则在转录水平上对PTEN进行增量调节［13］。

    3.2  p21、p73及PTEN在头颈部多原发癌、单发癌及正常上皮组织中的表达  由于肿瘤诊疗技术的提高，头颈部恶性肿瘤患者5年及远期存活率的延长，其患第二原发癌的机率逐年增高。随着分子生物学技术的不断发展，近阶段人们试图从基因和蛋白水平来解释多原发癌的发病机制。

    早在1953年Slaughter从组织病理学角度研究口腔肿瘤时提出了“区段性癌化”（field cancerization）理论，内容包括：(1)口腔肿瘤由多个癌前病变的病灶发展而来；（2）异常组织包绕肿瘤；（3）口腔肿瘤由多个相互独立的病损灶组成并常常又相互融合；（4）手术后持续存在的异常组织可解释多原发癌及局部复发的成因。其本质即是多原发癌的多中心、多克隆起源学术。近年来已有学者应用分子生物学技术分析肿瘤相邻的“正常”组织和手术切缘组织以证明区段性病变的存在。Tabor等研究头颈部肿瘤周围肉眼“正常”及手术切缘黏膜中p16、p53等多种抑癌基因杂合性缺失情况，38％的病例显示阳性结果，并在术后随访中观察到手术切缘存在杂合性缺失的患者有肿瘤再发的情况，且再发肿瘤的表现出不同的生物学行为，因而认为在头颈部肿瘤中存在“区段性癌化”现象，并与多原发癌的发生有关［14］。Homann等［15］运用免疫组化方法分析105例头颈部肿瘤患者的肿瘤组织及瘤旁上皮p53表达情况，结果显示46.7%的瘤旁上皮细胞存在p53高表达，第二癌的发生与瘤旁上皮细胞p53的过表达高度相关，认为至少部分第二癌的发生是因为黏膜的基因事件，即“区段性癌化”的结果。

    近年来多原发肿瘤的单克隆起源学说被提出。Califano等［16］认为，恶性肿瘤及癌前病变周围黏膜所检测到的组织病理学异常与肿瘤细胞起源于同一克隆系，是区域性浸润的结果；随后的基因突变事件引起细胞表型改变和细胞分化，从而导致这一解剖区域细胞的多亚克隆性，其中某一恶性转化细胞因其无限增殖的特性而发展成为肿瘤。在其它亚克隆株细胞上进一步的系列基因突变，则导致多原发癌的发生。Tabor等对10例口腔、咽部多原发鳞状细胞癌的先证癌和第二癌的癌细胞以及癌旁黏膜细胞行检测p53突变情况，对结果进行对比分析，认为大部分患者的先证癌和第二癌由同一癌前病变发展而来，起源于单一克隆细胞株；另有一部分患者的先证癌和第二癌则起源于相互独立的细胞克隆［17］。

    头颈部多原癌发生发展的分子机制研究虽已取得了一些成果，但还未形成公认的理论。本研究检测p21、p73及PTEN在头颈部多原发癌组织中的表达情况，并设立头颈部单发癌和正常上皮组织作为对照。类似的研究表明，cyclinD在上消化道多原发癌组织中的表达率高于单发癌，差异有统计学意义；p53的过表达率也有增高趋势，但差异无统计学意义［18］。本研究结果显示，在正常上皮组织p21和PTEN为高表达，p73为低表达。与正常上皮组织相比，多原发癌组和单发癌组均见有一定比例的p21、PTEN蛋白失表达和p73蛋白的过表达。以P＜0.05为差异显著性界限，经统计学检验p21、p73和PTEN的阳性表达率在多原发癌组与正常上皮组、单发癌组与正常上皮组间差异均具有显著性，而在多原发癌组与单发癌组间差异均无显著性。这一结果显示p21、PTEN的失表达以及p73的过表达在头颈部肿瘤组织中是一些频发事件，参与头颈部肿瘤的形成机制。然而与单原发癌组相比，虽然多原发癌组p21、PTEN的失表达率以及p73的过表达率更高一些，三个指标同时显示出这一特性也许不是偶然的事件，但这种差异尚远不能构成统计学意义上的显著性。按照肿瘤形成多阶段、多步骤过程的理论，细胞的恶性转化过程即是原癌基因激活和抑癌基因失活累积并达到一定程度的过程。从这一结果可以看出，p21、p73及PTEN作为细胞周期调控因子大家族的组成部分，在头颈部多原发癌组织中，其失表达或过表达虽是频发的事件，却不是必然或比头颈部单发癌组织中更为高发的事件。肿瘤形成的分子机制复杂，参与细胞增殖周期的调控因子种类与数量繁多，有关头颈部多原发癌发病的分子机制还需要做大量的相关研究工作。

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