依达拉奉对Aβ2535诱导分化PC12细胞NFκB p65基因表达的影响

　　作者：于明 包晓群 作者单位：江苏大学附属医院神经内科，江苏 镇江 212002

　　【摘要】目的 探讨依达拉奉(MCI186)对淀粉样β蛋白2535(Aβ2535)诱导的PC12细胞NFκB p65基因表达的影响。方法 实验对象分为3组：MCI186保护组(MCI186 20 μmol/L，Aβ2535 30 μmol/L)、Aβ2535干预组(Aβ2535 30 μmol/L)和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率;RTPCR检测NFκB p65 mRNA表达变化，Western印迹法检测NFκB p65蛋白表达的变化。结果 Aβ2535能增加NFκB p65 mRNA及其蛋白的表达，促进细胞凋亡;MCI186能抑制NFκB p65 mRNA及其蛋白的表达，抑制细胞凋亡。结论 MCI186具有神经细胞保护作用，可能的机制与其抑制NFκB p65 mRNA及其蛋白表达有关。

　　【关键词】 MCI 186 淀粉样β蛋白 PC12细胞 核转录因子

　　有人提出用自由基捕获剂或抗氧化的方法来治疗阿尔茨海默病(AD)。研究表明，淀粉样β蛋白(Aβ)能够通过核转录因子(NF)κB信号途径产生羟自由基(·OH)，进而引起氧化损伤〔1〕。MCI186(依达拉奉)可以通过特异性的清除·OH达到保护神经的目的，在治疗急性脑梗死上，显示出了显著的疗效〔2〕;MCI186也可以对抗Aβ2535诱导的PC12细胞氧化损伤作用，对AD的防治起着一定的疗效〔3〕，但其是否通过NFκB途径在AD中发挥作用，国内外尚未见报道。本文观察MCI186对Aβ2535诱导的PC12细胞NFκB mRNA及其蛋白表达的影响，为临床防治AD进一步提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞由吉林大学第一医院神经内科胡林森教授惠赠。

　　1.1.2 主要试剂 Aβ2535(首都医科大学宣武医院多肽室);MCI186〔依达拉奉(毕存)，南京先声东元制药有限公司，批准文号：国药准字H20031342〕;DMEM、胎牛血清(美国Gibco公司);四唑盐(Sigma公司);DL2000 DNA marker(北京鼎国);Taq DNA聚合酶(北京纽英伦生物技术有限公司);兔抗鼠NFκB p65抗体(美国Santa Cruz Biotechnology);引物由上海森工生物工程有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 将PC12细胞培养在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的孵箱中培养。3、4 d传代1次，隔天换液1次。

　　1.2.2 四唑盐比色实验(MTT)筛选分组 将对数期生长的PC12细胞消化，计数，以1×104/孔密度接种于96孔培养板上。开始时细胞共分为3大组、10小组：MCI186预处理组(6小组：将浓度为2 mg/ml的MCI186分别稀释成1、20、30 μmol/L，各预处理1 h和12 h后，再分别加入Aβ253530 μmol/L);Aβ2535干预组(3小组：将浓度为1 mmol/L的Aβ2535分别稀释成20、30、40 μmol/L)和正常对照组，每小组6复孔，使各孔细胞数基本相同。孵育24 h后，弃去原培养液，正常对照组加入含2.5%胎牛血清的DMEM维持液，另2大组按分组情况加入干预因素。继续孵育24 h后，弃培养液，每孔加入MTT 10 μl，孵育4 h。弃上清液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min使结晶充分溶解。酶联免疫仪570 nm波长检测各孔吸光度(A值)。对MTT实验结果进行统计学分析，结果显示随着Aβ2535浓度的增加，细胞活力下降，IC50大约为30 μmol/L;根据时间效应曲线，MCI186在预处理12 h且浓度为20 μmol/L时发挥着强大的神经保护作用，故我们将实验对象经筛选后分为3组：MCI186预处理组(MCI186 20 μmol/L,Aβ2535 30 μmol/L)、Aβ2535 干预组(Aβ2535 30 μmol/L)和正常对照组，分别对3组进行NFκB p65蛋白和NFκB p65 mRNA的检测。

　　1.2.3 NFκB p65 mRNA的检测 按Trizol试剂盒说明提取总RNA。用紫外分光光度仪测定A260/A280，比值在1.9～2.0之间，计算RNA含量。引物设计：①鼠NFκB p65：正义链：5′AAGATCAATGGCTACACAGG3′;反义链：5′CCTCAATGTCTTCTTTCTGC3′(扩增产物493 bp)②鼠βactin:正义链：5′ATTTGCACCACACTTTCTACA3′;反义链：5′TCACGCACGATTTCCCTCTCAG3′(扩增产物380 bp，为内参照)。逆转录反应按试剂盒操作。RTPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。

　　1.2.4 NFκB p65蛋白的检测 Western印迹法。总蛋白提取：4℃收集细胞，每孔加入100 μl细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH8.0 EDTA、1% NP40、0.05% PMSF、2 μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin)，超声破碎，4℃ 12 000 r/min离心5 min，收集上清液。细胞核蛋白提取：参照文献方法〔4，5〕，略改动。蛋白质样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5min，紫外分光法测定蛋白质浓度。按蛋白含量测定结果每孔上样50 μg，12.5% SDSPAGE分离样品。低温100 V 3 h将蛋白转至硝酸纤维膜上,用封闭液(5%脱脂奶粉、3%BSA、0.02% Tween20溶于PBS)室温封闭2 h，将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗大鼠NFκB p65多克隆抗体1∶500)室温孵育2 h，PBS洗5 min×3次，TBS洗5 min×4次，将膜与溶于二抗稀释液(5%脱脂奶粉、0.02% Tween20、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L TrisHCl，pH7.5)中的二抗室温孵育1 h，TBS洗5 min×4次，将膜装入可热接封的塑料袋中，加入ECL试剂，暗室曝光、显影、定影，对X光底片拍照保存。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR测定NFκB p65 mRNA结果 Aβ2535干预组PC12细胞内NFκB p65 mRNA表达较正常对照组明显升高，而MCI186预处理组PC12细胞内NFκB p65 mRNA表达较Aβ2535干预组明显减低，接近正常对照组的表达(见图1)

　　2.2 Western印迹法测定NFκB p65蛋白结果 Aβ2535干预组PC12细胞内NFκB p65蛋白表达较正常对照组明显升高;而MCI186预处理组PC12细胞内NFκB p65 蛋白表达较Aβ2535干预组明显减低，接近正常对照组的表达(见图2)。

　　3 讨 论

　　氧化应激是神经系统退行性病变发生的重要致病因素。中枢神经系统产生的氧自由基较多，而其自身又相对缺乏抗氧化物质，因此在外界因素(如Aβ沉积)的作用下，易生成大量的氧自由基及氧化产物，造成神经系统的损伤。研究证实Aβ可以诱导·OH产生，进而诱发氧化损伤，在AD的致病过程中起着重要的作用〔6〕。

　　NFκB是一种广泛存在于各种细胞、化学上高度保守、具有多种调节作用的免疫反应蛋白，是NFκB/Rel蛋白家族中的一员。Rel蛋白间可形成多种形式的同源或异源二聚体，最为典型的NFκB是由p50和p65(RelA)亚基组成，几乎存在于体内所有细胞中。在正常情况下，NFκB与抑制蛋白(IκB)相结合以非活性形式存在于胞浆内。当细胞接受胞外氧自由基(如Aβ)等刺激信号后，NFκB被激活迅速由胞浆向胞核移位，并与核内相应DNA上κB序列发生特异性结合，促进有关基因的转录，进而在炎症的发生、细胞的增殖与分化以及细胞凋亡的调节等方面起着重要作用。

　　目前，NFκB与细胞凋亡复杂关系日益受到重视。有学者认为NFκB是一种促凋亡因子，NFκB的激活可以促进某些细胞系的凋亡;也有学者认为NFκB是一种抗凋亡因子，NFκB的激活会抑制细胞凋亡〔7〕。国外学者研究还提出，在神经细胞中适度的NFκB活性可保护神经细胞免于氧化应激，而在小胶质细胞中NFκB的过度活化又可导致炎症级联反应。甚至有人指出NFκB即使在神经细胞凋亡网络中也具有双刃性，即NFκB既有抗凋亡作用又具有促凋亡作用〔8，9〕。

　　研究表明Aβ可以通过激活神经元内NFκB表达，诱导细胞凋亡，在AD发病机制中起着重要作用〔10〕。在本实验中，应用MTT法观察不同浓度Aβ2535(20、30、40 μmol/L)的毒性作用，发现随着Aβ2535浓度的增加，PC12细胞活力下降，IC50约为30 μmol/L，该浓度下的Aβ2535能够使NFκB p65 mRNA及其蛋白表达明显增加，这也进一步验证了Aβ可以通过激活PC12细胞内NFκB的表达引起细胞凋亡。同时，本研究结果还显示，在应用MCI186预先处理PC12细胞，再给予Aβ2535诱导后，可检测到NFκB p65 mRNA及其蛋白表达接近正常，说明MCI186可以抑制Aβ诱导的NFκB的激活，起到保护神经细胞的目的，其可能机制如下：MCI186作为一种新型抗氧化剂，可以通过①降低NFκB p65 mRNA的表达;②抑制NFκB核定位及其与DNA的结合;③阻止IκB磷酸化和降解等途径抑制NFκB，发挥抗凋亡作用，进而发挥保护神经细胞的目的。

　　综上所述，本研究认为：在体外，Aβ可以激活NFκB的表达，引起细胞氧化损伤;而MCI186可以通过抑制NFκB的活性保护神经细胞。但由于MCI186存在体内代谢、对细胞增殖可能的双向调节以及大剂量可能引发的药物的毒副作用等问题，其最终应用于AD的防治尚需全面论证。

　　【参考文献】

　　1 Tjernberg LO，Naslund J，Thyberg J,et al.Generation of Alzheimer amyloid beta peptide through nonspecific proteolysis〔J〕.J Boil Chem，1997;272(3)：18705.

　　2 狄 晴，葛剑青，陈道文，等.依达拉奉治疗急性脑梗死的临床观察〔J〕.临床神经病学杂志，2004;17：1846.

　　3 于 明，邬 巍，邬英全，等.依达拉奉对淀粉样蛋白β2535致PC12细胞氧化损伤的神经保护作用〔J〕.中国临床康复，2005;9：579.

　　4 Samy TA，Ayala A，Catania RA,et al.Traumahemorrhage activates signal transduction pathways in mouse splenic T cells〔J〕.Shock，1998;9(6)：44350.

　　5 Dignam JD，Lebovtz RM，Roeder RG.Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei〔J〕.Nucleic Acids Res，1983;11(5)：147589.

　　6 Smith JV，Luo Y.Elevation of oxidative free radicals in Alzheimer′s disease models can be attenuated by ginkgo biloba extract EGb 761〔J〕.J Alzheimers Dis，2003;5(4)：287300.

　　7 Fan Y，Dutta J，Gupta N,et al.Regulation of programmed cell death by NFkappaB and its role in tumorigenesis and therapy〔J〕.Adv Exp Med Biol，2008;615：22350.

　　8 Lee HJ，Kim SH，Kim KW,et al.Antiapoptotic role of NFkapaB in the autooxidized dopamineinduced apoptosis of PC12 cells〔J〕.J Neurochem，2001;76(2)：6029.

　　9 Song YS，Park HJ，Kim SY,et al.Protective role of Bcl2 on betaamyloidinduced cell death of differentiated PC12 cells：reduction of NFkappaB and p38 MAP kinase activation〔J〕.Neurosci Res，2004;49(1)：6980.

　　10 GarcíaOspina GP，JimenezDel Rio M，Lopera F,et al.Neuronal DNA damage correlates with a positive detection of cJun，nuclear factor κB，p53 and Par4 transcription factors in Alzheimer′s disease〔J〕.Rev Neurol，2003;36(11)：100410.