癫痫与神经元凋亡调控

　　作者：赵爽，黄瑞雅 作者单位：1.右江民族医学院病理生理学教研室，广西百色533000;2.右江民族医学院附属医院神经内科，广西百色533000

　　【关键词】 癫痫;神经元/ 凋亡

　　癫痫是一种神经元发作性异常放电引起的、以反复痫样发作为特征的临床症候群。癫痫持续状态(statual epilepticus，SE)导致脑损伤的发病率日益增高，严重影响到病人的健康和生活质量。国内流行病学调查资料显示癫痫发病率接近1‰，而患病率约为4‰～9‰。癫痫病因错综复杂，至今尚未完全阐明。在人类颞叶癫痫患者及各种SE模型中(电点燃或化学点燃、局部或系统给予致痫剂等)，用形态学或生化的方法均已证实，神经元的损伤具有典型的凋亡特征[1]。近年研究发现[2]，单次惊厥后即能引起脑细胞凋亡，并随着惊厥次数的增加凋亡细胞数也逐渐增多。SE致神经元凋亡的另一证据是与凋亡相关的各种基因出现表达的改变，如立刻早基因(immediate early genes，IEGS)、p53基因及bcl-2基因家族等[3]。目前人们又将SE后神经元损伤的研究重点转移到了线粒体，认为线粒体是调控SE神经元死亡的核心环节，线粒体的损伤、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)的大量释放和caspase-3的激活是神经元损伤的最后共同通路。这些发现将为SE脑保护的治疗开辟新的前景。

　　1 内源性凋亡途径

　　内源性凋亡途径的核心环节是线粒体膜通透性转运孔(permeability transition pore，PTP)打开和Cyt C释放，Bcl-2蛋白家族通过调节线粒体膜的通透性进而调控神经元凋亡[4]。SE可导致机体氧耗增加、呼吸暂停和血管舒缩功能异常，继发脑缺血缺氧反应[5]，诱导缺血缺氧性脑损伤等病理生理过程。NMDA受体被持续激活，细胞膜去极化导致电压依赖性钙通道持续开放，Ca2+大量内流，出现Ca2+超载，并通过激活立刻早基因等途径，引起一系列级联放大反应，导致神经细胞凋亡。大量疾病模型研究还发现，脑缺血-再灌注损伤、低血糖、NO等活性氧簇的大量产生，以及内质网内Ca2+失衡，也可造成错/未折叠蛋白积聚，导致一系列细胞内信号转导和相关基因激活，诱发内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)[6,7]。Henshall等[5]认为癫痫的病理生理过程可以激活触发ERS，其诱导启动的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)保护性适应和损伤机制均参与了惊厥诱导神经元损伤的过程，但具体机制尚不清楚。Sokka等[8]在红藻氨酸(kainic acid，KA)诱导的癫痫模型中也发现海马神经元内质网伴侣蛋白BiP、CHOP和caspase-12表达增加，而caspase-12是ERS介导细胞凋亡的关键效应分子。当应激过度时，ERS启动的内源性凋亡通路可与线粒体相关的凋亡通路协同参与细胞凋亡过程[9,10]，提示ERS反应性凋亡途径与经典凋亡通路存在着复杂的交联。

　　在Ca2+超载、活性氧产生以及氧化应激等作用下，PTP大量开放，离子和呼吸链底物在线粒体基质和胞质之间达到新的平衡，导致线粒体膜电位降低及ATP合成减少[11]。此外，水分到达线粒体基质，使基质肿胀，线粒体嵴紧张。由于线粒体外膜具有比折叠后的内膜小得多的表面积，线粒体外膜因此而断裂。随后，Cyt C由线粒体内膜被大量释放入胞浆，并与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease-activating factor-1，Apaf1)以2∶1的比例相结合，形成Cyt C/Apaf1复合体。该复合体可以使无活性的pro-caspase-9发生自身活化形成具有活性的caspase-9，继而再形成Cyt C/Apaf-1/caspase-9复合物，进一步作用于其下游的pro-caspase-3、6、7，活化的caspase-3、6、7可作用于细胞骨架蛋白或酶类，使DNA断裂，诱导神经元凋亡[12]。

　　Bim是一种隐藏在内质网动力蛋白复合体中的蛋白质，在SE模型中它会从复合体及与分子伴侣14-3-3蛋白形成的复合物中释放出来。免疫沉淀实验证明，Bim可与Bcl-w形成寡聚体[13]，推测这可以使Bad释放，随后Bax易位至线粒体而触发Cyt C释放[14]。Burgering等人报道称[15]，癫痫发作时，Bim表达上调;在体外癫痫模型中，当用反义寡核苷酸抑制Bim表达时，神经细胞存活率上升，这说明Bim途径在癫痫致细胞凋亡的过程中发挥着重要作用。在研究Bim上调和Cyt C释放的深层控制机制时，认为横纹肌肉瘤(FKHR)家族中的转录因子FKHR和FKHRL-1控制着Bim的表达[16]。在KA所导致的SE模型中观察到，磷酸化(无活性)FKHR及FKHRL-1的水平下降;去磷酸化(活性)形式的水平上升，并转移到细胞核，可使Bim表达增加，在体外实验中，癫痫样活动也会促使FKHR与Bim启动因子结合。利用原钒酸钠抑制FKHR和(或)FKHRL-1去磷酸化，则可以增加海马区神经元的存活率。

　　Bad的促凋亡通路为：正常生理状态下磷酸化的Bad与分子伴侣14-3-3蛋白结合组成无活性的复合物[16]。接受凋亡刺激后，钙调磷酸酶等诱导Bad去磷酸化，去磷酸化的Bad与分子伴侣14-3-3蛋白解离，Bad从构成性结合的Bcl-XL-Bax二聚体中置换并释放促凋亡因子Bax，Bax移位到线粒体，促使线粒体释放Cyt C，引起caspase级联反应导致细胞凋亡[12]。Bcl-2则主要通过抑制线粒体释放Cyt C对抗细胞凋亡。但是，Bad和Bcl-2是否在癫痫发作致神经元凋亡通路中起作用，则报道甚少。已有研究显示[17]，应用杏仁核内注射KA诱导的边缘叶发作癫痫模型中，观察到癫痫发作可诱导Bad去磷酸化，去磷酸化的Bad与分子伴侣14-3-3蛋白解离，然后Bad与Bcl-xl结合;磷酸化Bad表达减少而Bax表达增加，Bad的去磷酸化则具有脑神经元损伤作用。

　　2 外源性凋亡途径

　　死亡受体激活，如TNFR1与TNF-α、Fas与FasL的结合等是外源性凋亡调控途径的起始环节。这些激活的死亡受体通过其细胞内的死亡区域(death domain，DD)来分别募集胞浆衔接蛋白FADD(Fas-associated death domain)或TRADD(TNFR-associated death domain)。FADD通过其N末端死亡效应区(death effector domain，DED)的寡聚化并激活caspase-8酶原，形成细胞凋亡信号转导复合物(DISC)，并负责向下转导凋亡调控信号。TRADD一方面通过与FADD结合而诱导caspase-8酶原活化，另一方面则通过募集TRAF1、2(TNFR-associated factor1、2)及RIP(receptor interacting protein)等因子，通过一系列的信号转导，最终可以抑制caspase-8的表达。激活的caspase-8通过以下两个途径诱导凋亡：可以激活caspase-3，诱导凋亡途径的终末阶段;另外，活化的caspase-8也能裂解并激活Bid基因，通过增加线粒体通透性导致Cyt C释放，从而与内源性凋亡途径联系起来[12]。已有学者发现[18]，癫痫发作后，死亡受体TNFR1和Fas表达上调及其配基TNF-α和FasL均为释放增加，而caspase-8抑制剂则表现出对神经细胞的保护作用[19]，这样便有力地证实了外源性凋亡调控途径参与了SE后神经细胞的损伤过程。癫痫发作可诱导转录因子FKHR和FKHRL-1去磷酸化，致使促凋亡因子Bim增加，Bim可与Bcl-w形成寡聚体，从而触发Bax活化。癫痫发作还可以使Bad与分子伴侣14-3-3蛋白分离，被释放出来的Bad与Bcl-xl结合使Bax与Bcl-xl分离，Bax被释放出来。Bax可插入线粒体外膜使Cyt C从膜间隙释放入细胞质中，进而激活caspase-9，后者又可激活caspase-3。另外，caspase-8能水解(激活)Bid也可以使Cyt C释放，这样，内、外源性细胞凋亡途径便联系起来，即它有许多反应路线，最终以缓慢的依赖caspase途径使细胞凋亡，并伴有一定的形态学改变。

　　3 癫痫神经细胞凋亡的caspase机制

　　细胞凋亡是由细胞自身精确调控的自发的程序性死亡，广泛存在于体内各种生理及病理过程中。细胞凋亡常是由一个被称为caspase的半胱氨酸天冬酸蛋白酶家族激活引起的。一个细胞凋亡有多种caspase参与，不同细胞、不同刺激则可启动不同的caspase激活方式。caspase的激活有其自身的级联反应模式，即TNF、Fas等与信号蛋白结合以激活caspase-8，引起caspase级联反应，最后激活caspase-3，caspase-3是细胞凋亡最后的执行者，由它来完成致命性的DNA断裂;Cyt C从线粒体释放进入胞浆，在dATP的存在下与Apaf-1结合，激活caspase-9引起级联反应，激活caspase-3引起染色体断裂，细胞凋亡[20]。

　　线粒体可通过释放促凋亡因子激活caspase进而诱导凋亡，caspase也可通过Bcl-2家族来调控线粒体释放促凋亡因子，以放大凋亡级联反应。当细胞表面的死亡受体被激活后，活化的caspase-8可通过两个途径引起下游caspase活化：直接活化caspase-3;活化Bcl-2家族的Bid，通过Bid和线粒体膜上的Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak等相结合，促进线粒体释放Cyt C，从而引起caspase-3的活化，在Bid缺乏时，caspase-3激活受到影响，当然活化的caspase-3还可通过激活Smac途径加速神经细胞凋亡[21]。因此，caspase途径可通过调节蛋白酶、辅因子、反馈等方式来调控：Bax可促进Cyt C的释放，而Bcl-2则阻止Cyt C的释放，从而阻止辅因子Cyt C对caspase的激活;细胞凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis，IAPs)家族可抑制caspase的效应子(如caspase-3)的活性而阻止细胞凋亡。

　　由此可见，caspase家族是细胞死亡的蛋白酶家族，它介导神经元凋亡是周密策划并严格按照程序化来执行的，它可以直接破坏细胞结构、裂解DNA、阻止DNA的修复，最终导致神经元凋亡，这种细胞死亡途经的激活并不是“全和无”的现象，而是一种梯度级联反应死亡效应因子进行逐渐放大的过程，然而caspase活化的启动也并不是不可逆的，只要干预措施足够早，神经元凋亡同样也是可以被阻止的，神经症状也是可以减轻的。因此，抑制caspase活化将为神经系统疾病的治疗提供可能、合理、有效的药理学途经。

　　4 结语

　　有研究结果显示[22]，在癫痫大发作后12h就已出现神经元凋亡，而且随时间的推移，凋亡细胞数亦逐渐增加，在72h时达高峰。癫痫对神经元的损伤并未因其发作停止而终止，在发作停止后神经元凋亡还会持续一段时间。这提示，临床上寻找切实可行的有效措施，阻抑癫痫发作后神经元凋亡的发生，就有可能减缓癫痫发作所致的脑损害。综上所述，癫痫神经元凋亡受一系列基因调控，神经元凋亡可能是通过启动细胞自身内部的死亡机制发生的。目前有关癫痫神经元凋亡相关基因的表达研究越来越多且渐趋深入，同时也存在争议。癫痫脑损伤既是癫痫发作的结果，又是癫痫频发和难治的原因，更是癫痫致残(记忆力下降、智能和精神障碍以及痴呆等)的原因。因此探索癫痫的发病机制，寻求更为合理有效的治疗手段，将是医务工作者不懈努力的方向。可以预料，随着对凋亡基因研究的深入及对凋亡机制的阐明，用干预基因表达的方法治疗癫痫将成为最具潜力、最有突破性的手段之一。

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