遗传性中频听力障碍及其致病基因EYA4

作者：陈静　袁慧军　杨伟炎    作者单位：解放军总医院耳鼻咽喉－头颈外科（北京　100853）

【关键词】  听力障碍

　　听力障碍是一种很常见的言语交流障碍疾病。1991年Morton的调查显示：以言语频率平均听阈大于25 dB HL为标准，15% ～ 20% 的成年人患有听力障碍，而在大于80岁的人群中，该比例接近50%［1］。我国第二次残疾人抽样调查公布患听力残疾者占残疾人总数的2４．１６%。引起听力障碍的环境因素包括噪声、药物、感染和外伤等；遗传因素则可以通过单基因突变，多基因协同作用，或基因突变引起对环境损伤（如噪声、药物）的异常敏感而致聋。大于50%的语前聋是由遗传因素引起的，随着年龄增加，人群中的耳聋患病率也增加，反映了遗传因素和环境因素共同起重要作用［2］。随着环境因素得到有效控制，由环境因素致聋的比例有逐渐下降的趋势。相应的，遗传因素在听力障碍中的作用显得越来越明显。所以，临床耳鼻喉科医生有必要关注遗传性耳聋。而某些遗传性耳聋具有较典型的临床表现，这是重要的诊断和研究线索。比如常染色体显性遗传性耳聋DFNA10的患者发病早期听力损失集中于中频。为更好认识这种遗传性耳聋，现将DFNA10的临床表现及其致病基因EYA4做如下综述。

　　1　DFNA10的临床表现特点

　　遗传性耳聋可以分为综合征性和非综合征性两类。非综合征性耳聋（non-syndromic hearing impairment，NSHI）是指耳聋为单一遗传症状，在遗传性耳聋中占70%以上［3］。大约30%为综合征性耳聋(syndromic hearing impairment, SHI）［2］。SHI 除表现听力障碍外，还合并全身其他器官、系统的异常。引起非综合征性耳聋的基因座位被命名为 “DFN”（DeaFNess）。常染色体显性、隐性，X-连锁遗传的基因座位分别被称为DFNA、DFNB、DFN，名称之后的数字代表该基因座位被定位或提前预留的顺序。非综合征性耳聋的发病比例如下：DFNA约占22%，DFNB约占77%，DFN约占1%, 线粒体遗传约占1%［1］。目前命名的DFNA1到DFNA5７中有43个基因座位被定位，22个基因被克隆（Van Camp Ｇ, Smith R. Hereditary Hearing Loss Homepage［2008-05-28］）。大多数DFNA表现为迟发性耳聋（late-onset hearing loss），发病初期以高频听力损失最常见，逐渐累及其他频率。但也有一部分DFNA发病初期以低频或中频听力损失为主。当中频（０.5 ～2 kHz）的听力损失比低、高频更严重，则呈现谷型听力曲线，国外文献中也称之为“咬饼样听力图（cookie-bite audiogram）”。表现为中频听力障碍的常染色体显性遗传性耳聋有DFNA10，DFNA13［4］；而报道的DFNA8/12［5, 6］、DFNA28［7］家系中有些听力障碍首先发生在高频，也有些家系首先发生在中频。

　　到目前为止，文献报道的DFNA10家系共有5个（见表1）。1996年，O'Neill等［8］对一个常染色体显性耳聋的美国家系进行连锁分析，在6号染色体上发现了一个新的耳聋基因座位，定位于6q22 ～ 23上15 cM遗传距离的范围之内，命名为DFNA10。之后通过增加该家系成员，将范围缩小至6.0 cM，EYA4位于其中。胚胎发育过程中，包括听囊在内的许多组织中均表达EYA4，所以EYA4成为DFNA10位置和功能候选基因中的首选。２００１年Wayne［9］通过研究上述的美国家系和另一个比利时家系，将EYA4确定为DFNA10的致病基因。这些DFNA10家系在临床表现上具有共同点：均是迟发性耳聋，发病年龄6 ～ ５０岁。发病初期中频听力损失最明显，故听力曲线为谷型，之后高频、低频听力也逐渐下降而显示出下降型或平坦型听力曲线。   除耳聋之外没有伴发症状。关于耳聋的进展速度，          Verstreken［10］对比利时家系进行了详细记录和报道，0.5 ～  4 kHz平均听阈每年下降1.08 dB HL。而在美国家系，当听力损失不超过50 dB HL时， 0.25，4，8 kHz三个频率平均听阈每年损失0.6 dB HL，其中一名患病成员6岁到32岁纵向听力资料显示0.25 kHz 到8 kHz平均听阈每年损失2 ～    3 dB HL［11］。

　　２　EYA4和Eya基因家族

　　EYA4是脊椎动物Eya基因家族成员。脊椎动物Eya基因家族由四种转录激活因子（Eya1～Eya4）组成，是果蝇eya（eye absent）基因的同源基因。果蝇eya基因参与眼睛的形成［15］，携带eya基因突变的果蝇，眼睛发育障碍。

　　2.1　Eya基因家族蛋白

　　Eya基因家族的蛋白结构均有两部分组成：高度保守的羧基末端，由271个氨基酸组成，被称为eya同源区域（eya-homologous region，eyaHR）；多变的氨基末端（eya variable region，eyaVR）［16］（见图2）。对果蝇的研究显　　示［17, 18］，eyaHR和so（sine oculis）及dac（dachshund）基因的翻译产物共同参与调节蛋白-蛋白之间相互作用，ey (eyeless)能引起eya和so的表达。脊椎动物so基因的同源基因是Six基因家族成员，so和Eya蛋白结合，引起蛋白复合体的核转运［19］。果蝇eya和鼠类Eya1~3基因翻译产物的氨基末端具有转录激活作用，并且Eya基因的协同作用及其途径在物种之间具有保守性［18］。eyaHR在EYA蛋白家族中有重要作用，能调节和PAX、SIX、DACH的作用［20］。Eya1HR和Eya4HR蛋白都能和Six1结合，并伴随核转运。同时，Six1能结合特异性DNA启动子，结合亲和力被EyaVR调节。EyaHR突变蛋白不能和Six1相互作用，并在哺乳动物体内快速降解。

　　2.2　Eya基因家族表达的组织特异性

　　胚胎发育早期，Eya基因在组织中广泛表达。Eya基因家族的每个基因具有独特的表达方式，同时存在广泛重叠。比如，对鼠科动物的研究显示Eya1、Eya2和Eya4在胚胎期的中胚层和头部间充质都有表达，而在听囊表达的只有Eya1和Eya4。Eya3的表达局限于颅面和腮弓间充质，而在颅基板之下或周围有Eya1、 Eya2或Eya4的表达［21］。

　　2.3　人类EYA4基因的不同剪接形式

　　人类EYA4基因共有21个外显子，第一外显子不参与翻译。由于EYA4 不同的剪接形式而产生了不同亚型［22］（如图1）。为了确定在耳蜗表达的是哪种亚型，Wayne［9］对人胚胎耳蜗EYA4mRNA利用相应外显子5、16、19/20的引物进行了RT-PCR及测序，并且筛查了成人和人胚胎EYA4 的cDNA文库。 结果显示：人胚胎耳蜗中外显子5和较短形式的外显子16得不到扩增，但能扩增出外显子19和20。胚胎期大脑中只有外显子19表达。成人大脑中外显子19少量表达，但外显子20表达丰富。

　　3　 EYA4和EYA1突变引起不同的临床表现

　　目前发现EYA基因家族突变可导致3种与耳聋有关的人类遗传病。EYA1突变可引起腮-耳-肾（branchio-oto-renal，BRO）综合征［23］，BRO综合征最常见的特征表现是耳聋（98.5%），耳前瘘管（83.6%），腮器官的畸形（68.5%），肾脏畸形（38.2%），外耳畸形（31.5%）［24］。EYA4突变引起非综合征性耳聋DFNA10和一种综合征性耳聋：耳聋和扩张性心肌病［25］。　　　　Eya基因家族的蛋白结构彼此相似，为什么EYA1和EYA4突变引起的临床表现却不相同？啮齿动物胚胎早期Eya1和Eya4在听囊都有表达，但Eya4的空间分布比Eya1变化更大。当听囊分化成为听觉和前庭器官，Eya4在将发育成血管纹和Reissner’s膜的蜗管上层细胞中聚集，并在胚胎期18.5天由蜗管上层表达转换为由蜗管底部神经上皮表达。而Eya1的表达集中于Corti器的蜗管底部。从出生后1天到14天的成骨时期，Eya4在耳蜗囊也有强烈表达。发育期的前庭系统上皮中存在Eya4表达［9］。目前尚不能确定表达Eya4的上皮种类，但是可以肯定在胚胎发生过程中Eya4和Eya1的表达存在明显重叠。胚胎期Eya4和Eya１在结合SIX1方面显示出功能上的重叠、互补，这点和DFNA10耳聋患者缺乏先天性异常表型是一致的［11］。EYA4的胚胎期表达和DFNA10的临床表现为迟发性耳聋两种现象之间的分离也许反映了EYA4和EYA1在功能上的重叠主要是在胚胎发育阶段而非成熟期［26］。

　　4　EYA4突变的致病机制假说

　　导致显性遗传疾病表型的机制分为两大类：功能缺失和功能获得。典型的功能缺失提示单倍体剂量不足，包括基因量、基因表达或蛋白活性的降低。而功能获得提示增加的基因量、改变了的mRNA表达、增加或异常的蛋白活性，或称为显性负效应［27］。发生单倍体剂量不足的往往是调控基因，它们通常在接近阈值的情况下工作。构建等位基因同为野生型及杂合突变的EyaHR，并对不同的等位基因进行标记，发现野生型等位基因正常表达，突变      的EyaHR表达量明显减少。所以，单倍体剂量不足是       DFNA10表型的基础［26］。无义突变Eya4HR R564X和Eya1HR R539X及错义突变Eya1HR L504R与Six1的亲和力均显著降低，推测构象变化是Eya突变致病的原因［26］。Clark［28］等认为Eya基因家族除了在发育过程中发挥功能，也能作为凋亡前信号，过度表达的Eya能直接激活凋亡程序。细胞凋亡蛋白酶-3敲除小鼠表现为进展性耳聋，以及毛细胞退化和支持细胞增生［29, 30］。由于进展性耳聋是   DFNA10家系的重要表现，EYA4的凋亡机制异常也许和耳聋有关。

　　5　EYA突变类型及其临床表现

　　目前报道的5个DFNA10家系EYA4突变为：1个无义突变、3个移码突变，1个剪切位点突变。将突变种类简要的分为两种，截短突变（truncating mutation）：剪切位点突变、插入突变、无义突变、倍增突变和超过3bp的缺失突变；非截短突变（nontruncating mutation）：错义突变和3bp的缺失突变。前者造成了截短的蛋白，而后者的蛋白没有被截短。如图2所示：已报道的5个EYA4突变均为截短突变，造成了EYA4蛋白同源区域（eyaHR）不同程度的缺失或同时伴有可变区域（eyaVR）的部分缺失。那么是否只有截短的EYA4蛋白才会引起DFNA10的临床表现？显然，无法在已报道的DFNA10家系中进行分析。Zhang［26］对引起BRO综合征的EYA1突变种类和临床表现之间的联系进行了统计分析。通过比较35例BRO综合征基因型和临床表现发现：截短突变并非导致了更严重的临床表现。根据Eya突变致病是基于蛋白构象改变而引起的疏水性下降、电荷增加或某一位置的氨基酸侧链大小的改变，我们可以预测EYA4非截短突变同样会引起DFNA10的临床表现。EYA4突变还和一种综合征性耳聋：耳聋和扩张性心肌病有关，此病发生了EYA4基因4846 bp的缺失突变，同时累及了EYA4蛋白同源区域和大部分可变区域。Schonberger推测：EYA4蛋白缺失限于同源区域则只有耳聋表现，若同时累及可变区域则可伴发扩张性心肌病［25］。如图2所示：两个DFNA10美国家系中的EYA4突变同样也影响了小部分eyaVR，却没有心肌病的临床表现。所以，EYA4突变的致病机理及其和临床表现的联系有待于对新发现的DFNA10家系的进一步研究。

　　结束语　　　　DFNA10的研究结果可以用于指导聋病分子诊断，对具有DFNA10临床表现，携带EYA4突变的患者进行遗传咨询，比如：使患者了解疾病中的遗传作用，了解再发风险，进行产前咨询，选择合理治疗，积极对待疾病。今后遇到常染色体显性遗传性耳聋家系，尤其表现为谷型听力曲线者，提示我们考虑EYA4突变。对EYA4引起综合征性耳聋的研究显示：心肌病的发生和年龄相关，比耳聋症状出现的更晚。那么，需要详细的临床评估以发现早期病变和提前干预治疗。由于目前发现的DFNA10家系携带的EYA4突变均是截短突变，限制了突变形式和临床表现的关联性分析。为何EYA4基因突变所致的听力损失首先发生在中频？目前机制尚不明确。随着今后发现更多的DFNA10家系，建立EYA4定向突变小鼠， DFNA10的发病机制和EYA4蛋白在听觉系统的功能将会得到更好的阐明。　

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