阿司匹林联合脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后炎性反应的影响

　　作者：廖仁昊 陈立英 梁容仙 王敬 作者单位：保定市第一医院神经内科，河北 保定 071000

　　【摘要】目的 探讨阿司匹林(ASA)联合脑缺血预处理治疗对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组和ASA治疗组。各组采用ZeaLonga等的大脑中动脉线栓法并加以改进，制备缺血预处理及缺血再灌注损伤实验动物模型。在相应时间点比较各组神经功能缺失评分、脑梗死体积、血清神经元烯醇化酶(NSE)含量及脑组织白细胞介素(IL)1β和肿瘤坏死因子(TNF)α含量。结果 ASA联合脑缺血预处理可使神经功能缺损减轻、脑梗死体积缩小、血清NSE含量降低，均较缺血预处理组更为明显。脑组织IL1β和TNFα含量降低亦更为明显。结论 ASA可增强缺血预处理诱导的脑缺血耐受作用，下调脑组织再灌注损伤时IL1β和TNFα的表达，二者具有叠加作用。

　　【关键词】 阿司匹林; 脑缺血预处理; 白细胞介素1β; 肿瘤坏死因子α

　　近年来发现预先给予短暂的脑缺血预处理(BIP)可诱导缺血耐受(IT)〔1〕，从而减轻缺血再灌注所致的脑损伤。脑缺血再灌注后的炎症级联反应是神经元损伤的重要因素，抗感染治疗可减轻缺血再灌注所致的神经损伤〔2〕。阿司匹林(ASA)具有抗炎、抗血小板聚集等作用，是防治缺血性脑血管疾病的重要药物之一。 近年来研究发现，ASA除有抗血栓形成作用外，还有直接的脑保护作用〔3〕，但对IT影响的报道尚少见。本实验利用局灶缺血预处理模型，观察ASA对大鼠BIP后缺血再灌注损伤保护作用的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　选用健康雄性SD大鼠120只，由河北医科大学实验动物中心提供，体重250～320 g，随机分为4组：假手术组(n=40);脑缺血再灌注组，假手术3 d后给予2 h大脑中动脉闭塞(MCAO)，按再灌注时间分4个亚组(B1～B4)，即缺血2 h后分别再灌注6、12、24、48 h，每个亚组动物均为10只;BIP组，缺血预处理10 min，再灌注3 d后给予2 h MCAO;ASA治疗组，于缺血预处理10 min即开始给药，ASA 60 mg·kg-1·d-1溶于2 ml生理盐水中，灌胃，3 d后再次造成2 h MCAO。BIP组和ASA治疗组均按缺血2 h后分别再灌注6、24 h分为2个亚组，每个亚组动物均为10只。脑缺血再灌注组和BIP组予等量生理盐水灌胃。

　　1.2 缺血预处理及缺血再灌注模型制作

　　采用文献〔4〕法并加以改进。再灌注3 d后用相同方法再次造成MCAO 2 h，于各相应时间点进行神经功能缺失评分，心脏取血，后断头处死。以动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象)，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲，且一直存活到规定时间点为造模成功标志。假手术仅暴露颈总动脉及分叉处，不插线阻断大脑中动脉。各组动物术中均用白炽灯使其肛温维持在37℃左右。

　　1.3 指标检测及方法

　　1.3.1 神经功能缺失评分

　　按Longa等〔4〕的5级评分法评分：0级，无功能障碍;1级,不能伸展右侧前肢;2级，向右侧旋转;3级，向右侧倾倒;4级，无自主活动伴意识丧失。

　　1.3.2 血清神经元烯醇化酶(NSE)的测定

　　神经功能缺失评分完毕后，取心脏血2 ml，离心后取血清，置-20℃冰箱内保存，整批待测。

　　1.3.3 脑梗死体积测定

　　取血完毕后，每组各随机选取5只动物，以10%的水合氯醛深麻醉后处死，取左侧大脑半球，冠状面均匀切成2 mm厚脑片，迅速放入2%的2,3,5三苯基氯化四氮唑溶液(37℃)中染色30 min，然后用10%的甲醛缓冲液固定。24 h后照相测每个层面梗死灶面积，将各脑片梗死面积之和乘以厚度(2 mm)为总的梗死体积。

　　1.3.4 脑组织白细胞介素1β(IL1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)含量测定

　　每组另外5只动物用10%的水合氯醛深麻醉后处死，迅速取出鼠脑，剥离左侧皮质，称重后按400 mg∶1 ml加生理盐水制脑组织匀浆，匀浆液3 000 r/min低温离心15 min，取上清液置-20℃冰箱内待测。后采用FTDFγ晶体闪烁计数仪(北京核仪器厂生产)，测定脑组织IL1β和TNFα的含量。试剂盒均由解放军总医院科技开发中心放免所提供。

　　1.4 统计学处理

　　数据用x±s表示，用SPSS10.0统计软件处理，多组比较进行方差分析及两两比较q检验，两组间比较采用t或t′检验。

　　2 结果

　　2.1 神经功能缺失评分

　　假手术组无神经功能缺失表现。BIP组、ASA治疗组神经功能缺失评分与相应时间点的缺血再灌注组比较有显著性差异(P<0.01)。ASA治疗组神经功能缺失评分明显降低，与BIP组比较差异显著(P<0.01)，见表1。表1 各组脑缺血再灌注后不同时间点神经功能缺失评分的比较(略)

　　2.2 血清NSE含量

　　脑缺血再灌注组各个时间点血清NSE含量，与相应时间点的假手术组比较明显升高(P<0.05)。BIP组、ASA治疗组与相应时间点的脑缺血再灌注组比较血清NSE含量降低(P<0.01)。ASA治疗组与BIP组比较血清NSE含量降低(P<0.01)，见表2。

　　2.3 脑梗死体积

　　假手术组无肉眼可见的梗死灶形成。脑缺血再灌注组梗死体积6 h为(175.78±19.33) mm3，24 h为(179.37±16.96) mm3。BIP组梗死体积6 h为(96.15±21.16) mm3，24 h为(99.36±18.95) mm3。ASA治疗组梗死体积6 h为(63.55±17.56) mm3，24 h为(67.44±23.04) mm3。BIP组、ASA治疗组与相应时间点的脑缺血再灌注组比较梗死体积明显缩小(P<0.01)。ASA治疗组与BIP组比较梗死体积缩小更加明显(P<0.05)。表2 各组脑缺血再灌注后不同时间点血清NSE含量的比较(略)

　　2.4 脑组织IL1β和TNFα含量

　　脑缺血再灌注6 h病变侧脑组织IL1β和TNFα含量达到高峰，之后略有下降。脑缺血再灌注组各个时间点脑组织IL1β和TNFα含量较假手术组明显增高(P<0.01)。BIP组、ASA治疗组与相应时间点的脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL1β和TNFα含量降低，并有显著性差异(P<0.05)。ASA治疗组与BIP组比较病变侧脑组织IL1β和TNFα含量降低(P<0.05)，见表3。表3 各组脑缺血再灌注后不同时间点脑组织IL1β、TNFα含量的比较(略)

　　3 讨论

　　脑缺血后的再灌注往往引起较缺血本身更为严重的损害。再灌注损伤的病理特征主要为中性粒细胞浸润。在某些动物实验中应用抗中性粒细胞抗体使中性粒细胞减少，能使受损部位的面积缩小，提示在再灌注损伤中，中性粒细胞为主要的介导因素，各种炎症因子的释放起着重要的作用〔5〕。脑缺血再灌注后，损伤区内皮细胞、神经元、星形细胞和血管周围的炎性细胞即被激活，通过释放两种关键的细胞因子(IL1β和TNFα)而触发炎症反应，导致神经元损伤〔6〕。IL1β、TNFα作为炎症反应的起始因子，检测其含量对衡量脑缺血再灌注损伤有重要意义。本次实验结果与相关报道一致〔7〕，表明IL1β、TNFα参与脑缺血再灌注损伤的发生，在脑缺血性疾病的发生、发展和转归中起一定的作用。

　　近年来发现预先给予短暂的BIP可诱导IT〔1〕，激活内源性神经保护机制，抑制缺血后的炎症反应，从而减轻缺血再灌注所致的神经损伤。本次实验我们发现，提前给予BIP可以使再次缺血时神经功能缺失减轻，梗死体积缩小。从而证实了BIP所诱导的IT现象的存在。并且还发现提前给予BIP可以使再次缺血时血清NSE含量下降，而NSE是中枢神经系统损伤的敏感性和特异性标志，提示BIP对大鼠脑缺血再灌注损伤产生保护作用。我们的研究发现BIP可减轻再次缺血时IL1β、TNFα的表达，对缺血再灌注产生保护作用，最终减轻组织学损害。

　　业已证实，炎症反应可能在缺血再灌注损伤及脑IT中具有重要意义,抗感染治疗可减轻缺血再灌注所致的神经损伤〔7〕。近年来随着对ASA研究的深入，越来越多的实验证明其有神经保护作用，抑制缺血后的炎症反应，从而减轻缺血再灌注所致的神经损伤〔3〕。本实验我们发现，ASA可能对BIP诱导的IT有一定的增强作用，二者对脑缺血再灌注损伤IL1β和TNFα的表达下调可能具有叠加的促进作用，进一步从分子水平提示抗感染治疗可增强BIP所诱导的IT，二者具有叠加效应。ASA增强IT的机制尚不明确，可能与其能有效地阻止前炎性细胞因子过量表达及其生物学作用的发挥，减少缺血区白细胞渗出与浸润，减轻缺血后炎症反应有关。尽管本研究初步表明在缺血预处理的基础上给予ASA治疗，可能增强IT，但在临床上应用抗炎治疗是否能增强短暂性脑缺血发作后机体的内源性脑保护作用，尚有待进一步研究。

　　【参考文献】

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　　3 Khayyam N,Thavendirinathan P,Carmichael FJ,et al.Neuroprotective effects of acetylsalicylic acid in an animal model of focal brain ischemia〔J〕.Neuroreport,1999;10(2)：3714.

　　4 Longa EZ，Weinstein PR，Carson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainietomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):8491.

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　　7 Hartl R，Schurer L，Schmidschonbein GW,et al.Experimental antileukocyte interventions in cerebral ischemia〔J〕.J Cere Blood Flow Metab，1996;16(6):110810.