大鼠脑梗死模型中载脂蛋白J mRNA表达的研究

　　作者：李艳玲，何志义 作者单位：(中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 110001)

　　【摘要】 目的 探讨载脂蛋白J (ApoJ ) 在大鼠脑梗死急性期的作用及其机制。方法 清洁级SD雄性成年大鼠70只,随机分为正常对照组、假手术组、脑梗死后6 h组、24 h组、3 d组、5 d组和7 d组。用线栓法制备永久性局灶性脑梗死模型,动物处死后检测ApoJ及补体C3mRNA的表达值。结果 各模型组手术侧ApoJ mRNA表达和C3mRNA表达水平均高于正常对照组及假手术组(P<0.01),C3的表达从脑缺血后6 h起高于对照组,而ApoJ在缺血后24 h才出现表达增强。ApoJ mRNA表达值与补体C3 mRNA表达水平呈正相关(r=0.427,P<0.01)。结论 大鼠脑梗死后补体C3激活,ApoJ的表达代偿性增高,以抑制补体的活性,从而抑制补体介导的神经元死亡,起神经元保护的作用。

　　【关键词】 载脂蛋白J;补体C3;脑梗死

　　The Research on Expression of ApoJ mRNA in Rat Cerebral Infarction ModelsLI Yanling, HE Zhiyi

　　(Neurological Institute , the First Hospital of China Medical University ,Shenyang 110001 China)Abstract：Objective To investigate the mechanism of the neuroprotective effect of ApoJ in rat acute cerbral infarction.Methods 70 healthy male SD rats were divided randomly into normal control group,shamoperated group, cerebral infarction 6 hour group, 24 hour group, 3 day group, 5 day group and 7 day group. Permanent cerebral infarction models were prepared by occluding the middle cerebral artery (MCA) using thread embolizing，the C3 and ApoJ mRNA expression was analyzed by RT-PCR.Results An increased expression was found in ischemia rat brain and a low level expression ApoJ mRNA was detected in normal rat brain, a positive correlation found between C3 mRNA and ApoJ mRNA expression (r = 0.427，P<0.01).Conclusions Increased ApoJ expression may be invoved in neuroprotection in cerebral infarction by inhibiting the complement activation.

　　Key words： ApoJ; complement component C3; cerebral infarction

　　载脂蛋白J(Apolipoprotein J,ApoJ)是Desilva 等人从血清中分离提纯出一种新的酸性糖蛋白，可与脂质结合成脂蛋白，存在于血浆中[1]。ApoJ在人体不同组织和体液中广泛存在,在脑中浓度最高;有研究表明ApoJ具有结合和转运脂质、抑制补体活化及保护细胞膜等功能[2]。ApoJ在许多病理过程中有所表达, 许多神经系统疾病ApoJ的表达均显著增高。本文拟对大鼠脑梗死模型脑内的ApoJ表达及可能的作用机制进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　清洁级雄性SD大鼠70只,体重60～120 g ,鼠龄3～4 个月,随机分为正常对照组、假手术组、脑梗死后6 h组、24 h组、3 d组、5 d组、7 d组,每组10 只。

　　1.2 检测指标

　　用RT-PCR方法检测ApoJmRNA及补体C3mRNA表达值,以补体C3mRNA表达值作为补体激活的评价指标。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 脑梗死模型制备

　　用线栓法制备永久性脑梗死模型,出现局灶性神经功能缺损者为模型制备成功,无神经功能缺损但经TTC 染色(盐酸2，3，52三苯基四氮唑) 证实脑组织内有梗死灶存在者仍视为模型制备成功。

　　1.3.2 半定量RT-PCR法检测ApoJ mRNA及C3mRNA表达

　　分别取双侧脑组织匀浆,用一步法总RNA 提取试剂盒提取总RNA;用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成CDNA;将cDNA在PTC220型PCR 热循环仪上进行扩增:ApoJ引物序列为TACAGTTCCCGGATGTGGAT, CACGAGAGGGGACTTCTGAG,反应条件为95 ℃ 5 min,[95 ℃60 s,-60 ℃60 s,-72 ℃60 s]×28,-72 ℃7min;C3 引物序列为GACCTGCGACTGCCCTACTCT , CTGATGAAGTGGTTGAAGACGG,反应条件为95 ℃ 5 min ,[95 ℃60 s ,-58 ℃60 s ,-72 ℃60 s]×30 ,72 ℃7 min;β-actin引物序列为GTAGCCATCCAGGCTGTGTT,CAGTGAGGCCAGGATAGAGC(用计算机设计,Locus :actx ,Accession :NM-031144)。内对照β-actin与目的基因ApoJ及C3分别在同一反应体系中同时扩增。将ApoJ与补体C3的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳,在Eagle Eye Ⅱ型图像处理系统上测量ApoJ及C3电泳带的光密度,用β-actin 作为参照,求出ApoJ和C3的相对值。

　　1.4 统计学处理

　　测定结果用±s表示。成组设计多个组与一个组均数间的比较用LSD法和Duncan新法检验;两个均数间比较用t检验。两变量间的相关分析用Kendall's tau-b相关检验。所有数据使用SPSS11.0软件进行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 ApoJ mRNA表达

　　正常对照组及假手术组大鼠大脑内可见ApoJ mRNA 低水平表达;大鼠脑梗死后6 h手术侧ApoJ mRNA表达水平与正常对照组仍无显著性差异,而24 h组、3 d组、5 d组、7 d组大鼠手术侧ApoJ mRNA表达显著增高,其中3 d组达峰值,其表达值为正常对照组的2.6倍,但各模型组非手术侧ApoJ mRNA 表达水平与正常对照组大鼠相比并无显著性差异(P>0.05)(见表1及图1、2)。李艳玲，等：大鼠脑梗死模型中载脂蛋白J mRNA表达的研究辽宁医学院学报 2008年8月，29(4)表1 各组大鼠补体C3、ApoJ mRNA表达值 注：手术侧与正常对照组比较，·P<0.01;与假手术组比较，◇P<0.01;与3 d组比较，▲P<0.01;非手术侧与手术侧比较，△P<0.01

　　2.2 补体C3 mRNA 表达

　　正常对照组及假手术组大鼠脑内补体C3 mRNA 可见低水平表达;各模型组手术侧C3 mRNA表达水平均高于正常对照组及假手术组,差异有统计学意义(P<0.01),其中3 d组补体C3 mRNA表达最高,其表达值为正常对照组的4.5倍,5 d组及7 d组表达水平逐渐降低,但各模型组非手术侧C3 mRNA 表达水平与正常对照组大鼠相比无显著性差异(P>0.05，见表1及图3、4)。

　　2.3 各检测指标间的相关关系研究

　　补体C3 mRNA与ApoJ mRNA表达水平之间呈正相关(r=0.427,P<0.01，见图5)。

　　图5 补体C3与ApoJ mRNA表达的关系

　　3 讨 论

　　载脂蛋白J(ApoJ)是杂二聚体的糖蛋白,由α和β亚基通过二硫键相连而成，相对分子质量约70 000～80 000。ApoJ广泛地分布于体内各种组织和生物体液中,在脑中浓度最高，具有结合和转运脂质、抗动脉粥样硬化、抑制补体活化、减轻免疫炎症反应、调节精子的成熟、抗细胞凋亡、调节内分泌以及促进细胞间的相互作用、对细胞膜具有保护作用[3]。ApoJ与已确定结构的ApoA，B，C，D，E不同[4]。过去对短暂性脑缺血的研究中发现,缺血脑组织中ApoJ 的表达明显增高[5]，ApoJ的这种神经元保护作用的机理目前还未阐明，可能与补体有关[6]。本研究表明,大鼠脑梗死后6 h手术侧ApoJ mRNA表达水平与正常对照组仍无显著性差异,而24 h组、3 d组、5 d组、7 d组大鼠手术侧ApoJ mRNA表达显著增高,P<0.01,具有显著差异,其中3 d组达峰值,其表达值为正常对照组的2.6倍。Zoli等在对短暂性前脑缺血的研究中发现,坏死区周围部分存活的神经元内有ApoJ 的沉积,认为ApoJ可能起保护缺血神经元的作用[7]。ApoJ的这种神经元保护作用可能是通过抑制补体激活,从而阻止补体介导的神经损伤而实现的，补体成份C3在补体系统激活的三条途径中均起着关键作用，C3 mRNA表达增高，提示补体系统激活。ApoJ能与补体成份C9竞争,抑制C9与C5b28、C5b29及C5b27的结合,形成一个水溶性的无溶细胞活性的复合物,从而阻止膜攻击复合物的形成[8]。为证明以上推论,我们对缺血脑组织中的ApoJ与补体成分C3表达之间的相关关系进行了研究。本研究结果表明,各模型组手术侧C3 mRNA表达水平均高于正常对照组及假手术组,差异有统计学意义(P<0.01)，ApoJ mRNA的表达随C3 mRNA表达的增高而增高,两者之间呈显著正相关。从各时间点的表达情况来分析,补体C3的表达增高要早于ApoJ,C3的表达从脑缺血后6 h起便高于对照组,而ApoJ在缺血后24 h 才出现表达增强,这提示随着脑缺血后补体系统的激活,ApoJ的表达代偿性增高,以抑制补体的活性,从而抑制补体介导的神经元死亡,起神经元保护的作用。在脑梗死急性期内ApoJ表达显著增高,可能通过其补体调节功能抑制补体系统激活,从而在脑梗死急性期起保护神经元作用。

　　【参考文献】

　　[1] Desilva HV, Stuart WD,Duic LR , et. al.Apolipoprotein designated apo J is a marker for subclasses of human plasma high densitylipoproteins[J].J Biol Chem , 1990，265(1):32-40.

　　[2] Rosernberg ME, Silkensen J.Clusterin：physiologic and pathophysiologic considerations[J].Int J Biochem Cell Biol, 1995,115(11):243-253.

　　[3] Rosenberg ME ,Silkensen J.Clusterin:physiologic and pathophysiologic considerations,int[J]. J Biochen Cell Biol,2002,27(4):633-645.

　　[4] May PC ,Robison P ,Fuson K. Sulfated glycoprotein expression increases in rodent brain after transient global ischemia[J].Brain Res Mol Brain Res,1992,15 (122) :33-39.

　　[5] Schafer MK,Schwaeble WJ , Post C ,et al. Complement Clq is dramatically upregulated in brain microglia in response to transient global cerebral ischemia[J]. J Immunol ,2000 ,164 (10) :5446-5452.

　　[6] 刘秉问. ApoJ的结构与功能[J].生物化学与生物物理进展，1994，21(4):294-299.

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　　[8] 杜丽蓉.ApoJ的研究进展[J].国外医学分子生物学分册，1995，17(2): 83-85.