碱性成纤维细胞生长因子和银杏叶提取物对实验性脑梗死的作用
发表时间：2009-11-25 浏览次数：724次
碱性成纤维细胞生长因子和银杏叶提取物对实验性脑梗死的作用作者：贺丹 作者单位：050000石家庄，河北医科大学第二医院医学影像科 【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和银杏叶提取物（GbE）对实验性脑梗死的作用。方法 健康家猫40只，随机分为生理盐水对照（A）组、bFGF治疗（B）组、GbE治疗（C）组和bFGF+GbE联合治疗（D）组；采用左侧眼眶入路制作猫大脑中动脉缺血再灌注模型；制模后即刻、24 h、48 h分别给予相应的药物干预；制模后1 d、7 d分别进行神经功能缺损评分；制模后7 d对脑组织切片进行光镜和电镜下病理及超微结构观察。结果 D组神经功能缺损评分（41.50±8.18）明显低于A组（82.20±8.08）、B组（63.60±6.22）和C组（61.00±6.58）（均Ｐ<0.01）；光镜下D组神经细胞核轻度皱缩，细胞周围间隙大致正常，神经纤维网疏程度不严重；电镜下D组神经元轻度变性，细胞核无皱缩，核膜完整，线粒体轻度肿胀；脑组织病理损害程度较B组和C组明显减轻。结论 bFGF和GbE联合治疗实验性脑梗死疗效优于二种药物的单一用药，两药合用具有脑保护的协同作用。 【关键词】 脑梗死 碱性成纤维细胞生长因子 银杏叶提取物 Effects of basic fibroblast growth factor and Gingkgo biloba extra on experimental cerebral infarction HE Dan, LIU Huai-jun,WU Shuo-chun,et al.Department of Radiology，the Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China Abstract：Objective To study the effects of basic fibroblast growth factor （bFGF） and Gingkgo biloba extra（GbE） on experimental cerebral infarction. Methods 40 healthy adult cats were equally devided into group A with sodiumchloride, group B with bFGF, group C with GbE and group D with bFGF+GbE in random.All animals were operated to establish the feline models of cerebral focal ischemia-reperfusion by the approach of left transorbital. The certain madicine intervene were take at 0 h,24 h,48 h after the models established.The neurological defects score was evaluated by Philips’ criteria score in 1 d and 7 d. The physiological changes were observed by HE stained and electron microscope.Results The neurological defects score was singificiant lower in D group（41.50±8.18） than that in group A（82.20±8.08），B（63.60±6.22） and C （61.00±6.58）（allP<0.01）.Compared with groups A，B，C, group D showed that the cellular nucleus was shrinkaged slightly,the gap of cells was nomal roughly and the degree of rarefaction in neurofibra net was not serious under the light microscope.Under the electron microscope,the neuron was degenerated,the cellular membrane was integrated and the plastosome was swelled lightly in the group D.The physiological demage were slighter in D group.Conclusions There is batter curative effect in bFGF combinated GbE than in single of bFGF or GbE to treat experimental cerebral infarction, and can enhance brain protection. Key words：cerebral infarction；basic fibroblast growth factor；Gingkgo biloba extra 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和银杏叶提取物（GbE）治疗脑梗死均具有一定的疗效［1］。本实验通过对脑组织病理学变化与动物行为学表现进行比较，观察bFGF联合GbE对脑梗死的治疗作用。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物及分组 健康成年家猫40只,体质量（3.5±0.2）kg,雌雄不限。随机分为生理盐水对照（A）组、bFGF治疗（B）组、GbE治疗（C）组和bFGF+GbE联合治疗（D）组，每组10只。 1.1.2 治疗制剂 bFGF每支含16000～30000 AU，北京双鹭药业股份公司生产；GbE注射液每支5 ml（商品名：金纳多）,德国威玛舒培博士药厂生产。 1.2 方法 1.2.1 模型制作 采用左侧眼眶入路制作猫大脑中动脉缺血再灌注模型。动物麻醉成功后，固定于自制手术台上，首先沿上睑结膜和球结膜交汇处切开结膜，逐层分离组织至眶后壁，剥离眼球与眶壁间组织，清除晶状体、玻璃体和球后脂肪，暴露视神经孔。于视神经孔旁颞上部开一大小约7 mm×9 mm骨窗暴露硬脑膜，小眼科剪剪开硬脑膜，暴露大脑中动脉M2段，显微血管夹小心夹闭所见大脑中动脉M2段近段，血管夹闭持续2 h后开放，缝合硬脑膜，骨蜡填塞骨窗缺损区，浸有庆大霉素纱布加压填充眶内，丝线缝合眼睑，敷包扎眼部。 1.2.2 药物干预方法 家猫后肢小隐静脉置入静脉留置针,于制模后0 h、24 h、48 h各组分别经静脉给予相应的药物干预。A组：生理盐水50 ml；B组：生理盐水50 ml+ bFGF 2 ml；C组：生理盐水50 ml + GbE 5 ml；D组生理盐水50 ml + bFGF 2 ml+ GbE 5 ml。 1.2.3 神经功能缺损评分 制模后24 h和第7 d动物处死前，根据Philip猫脑缺血神经功能评分标准，从意识、运动、感觉、视觉、姿势、平衡6方面对动物模型进行评分，得分越高，神经功能损伤程度越重。 1.2.4 脑组织切片制作 各组动物制模后第7 d，麻醉成功后开颅，取梗死部位及周围1 cm×1 cm×1 cm脑组织标本，置4%多聚甲醛溶液中固定12 h，0.01 mmol/L PBS 中清洗过夜，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。行石蜡冠状切片，片厚6 μm。HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察梗死灶中心和周围神经元及周围间隙变化。另取血肿灶周 1 mm×1 mm×2 mm的脑组织标本，放入预冷至4℃的3%戊二醛溶液中固定。经1%锇酸后固定2 h（4℃），梯度丙酮脱水，Epon812包埋，LKB超薄切片机行半薄切片，片厚1 μm；经饱和氢氧化钠无水乙醇脱树脂，1%甲苯胺蓝染色，行超薄切片。经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后，日立H-7500型透射电镜下观察梗死灶中心和周围神经元的核仁、核膜、线粒体、高尔基复合体、内质网等超微结构变化。 1.2.5 统计学方法 采用SPSS 10.0软件对实验资料进行统计学处理；所有数据用均数±标准差（x±s）表示，经正态性分析和齐性检验后，组间比较进行方差分析。2 结 果 2.1 各组动物神经功能缺损程度评分的比较 见表1。术后各组动物麻醉苏醒后皆出现神经功能缺损症状，表现为不同程度头后仰、对侧肢体瘫痪、抽搐及转圈。术后第1 d,4组评分差异无统计学意义。术后第7 d, B组、C组、D组评分明显低于A组（均Ｐ<0.01）,D组较B组、C组降低更明显（均Ｐ<0.01）；B组、C组间差异无统计学意义。表1 各组动物神经功能缺损评分的比较（略）注：与A组比较*Ｐ<0.01；与B组、C组比较△Ｐ<0.01 2.2 各组病理形态学改变 光镜下,A组脑组织疏松，细胞和血管周围间隙变大，白质中的变化较灰质更为明显；梗死灶、灶周脑组织（半暗带）、缺血区周围脑组织之间的分界清楚；梗死灶中心正常结构消失，神经元广泛变性坏死，细胞破碎；灶周神经元严重皱缩，呈三角形，核固缩，有时可见空泡样改变，细胞周围间隙明显增宽，表现为一条明显的“宽带” 围绕在梗死灶周围（图1）。B组、C组梗死灶中心神经元中度皱缩，细胞核固缩程度较轻，灶周病变神经元分布的宽度要明显窄于A组（图2）。D组神经元变性程度较轻，细胞核轻度皱缩，细胞周围间隙大致正常，神经纤维网疏程度不严重；存活和维持正常形态的神经元数量相对较多，变性细胞相对较少（图3）。 电镜下,A组神经元及神经胶质细胞广泛坏死，明显肿胀，细胞内外均充满大量水肿液，细胞核皱缩，核膜断裂；细胞器数量减少，变性严重；线粒体明显肿胀，嵴断裂、消失，膜结构不完整或局部消失，电子密度下降，部分线粒体表现为髓样变，似年轮状，或呈空泡状改变，粗面内质网明显肿胀，有脱颗粒现象，高尔基复合体扩大，呈空泡样；可见大量次级溶酶体出现（图4）。B组及C组神经元及神经胶质细胞轻-中度变性坏死，细胞核皱缩减轻，核膜完整；细胞内外有少量水肿液，细胞器变性情况亦减轻；线粒体肿胀，但嵴结构尚存在，膜结构模糊；粗面内质网、高尔基复合体中度变性（图5）。D组神经元轻度变性，细胞核无皱缩现象，核膜完整；细胞内外水肿液消失，仅在高倍镜下可见线粒体轻度肿胀，膜结构较完整，粗面内质网及高尔基复合体轻度变性（图6）。3 讨 论 脑缺血时，由于能量丧失和兴奋性氨基酸受体激活、神经元内Ca2+水平异常升高，导致细胞骨架和膜破坏，同时激活激酶、蛋白酶和自由基的产生，对脑组织产生损害作用。有研究［2］发现bFGF能够通过调节蛋白激酶，包括钙结合蛋白、自由基清除酶以稳定细胞内钙平衡，减少神经细胞凋亡，提高线粒体功能发挥保护神经元的作用；同时bFGF也是神经营养因子，能够促进轴突生长所需要的营养物质的产生，促进神经元轴突的生长，形成复杂的枝状轴突网络，促进神经功能的修复［3-5］。 GbE作为活血化瘀类中药，其有效成分为银杏苦内酯（>6%）和银杏黄酮（>24%），其具有抗氧化作用，直接清除O2 、OH-、H2O2，终止自由基连锁反应链来阻止氧自由基反应和脂质过氧化反应，并通过直接拮抗谷氨酸受体来抑制谷氨酸引起的钙水平升高，从而避免加重钙超载，有利于缓解脑水肿，减轻神经元损伤［6］。新近研究［7］发现GbE能明显促进缺血小鼠神经功能恢复和延长存活时间，对脑缺血脑组织有一定保护作用。 缺血后脑损伤的机制是多种因素作用的结果，最理想的治疗应该是联合应用阻断脑缺血级联反应不同环节的药物。本实验应用GbE干预,是针对缺血再灌注引起的钠水潴留，通过发挥抗脂质过氧化作用，捕获多种自由基，保护膜结构和功能，避免加重Ca2+超载，有效减轻脑水肿；bFGF则通过减少细胞内Ca2+浓度，稳定和提高线粒体功能，减少神经细胞凋亡；同时维持树突完整性和促进轴突生长的作用，促进神经功能修复［3］。本实验结果表明bFGF、GbE单独或联合用药对改善神经功能缺损、减轻组织病理损害均有明显的作用，而联合用药组病理表现和神经功能恢复明显优于单一用药组；应用bFGF联合GbE治疗猫急性脑梗死具有协同治疗作用。本实验为中西医结合及药物联合应用治疗脑梗死提供了实验依据。【参考文献】 ［1］王静娥，张朝东.碱性成纤维细胞生长因子在神经元死亡和损伤修复中的反应［J］.中国临床康复，2003，7：1070. ［2］House SL, Melhom SJ, Newman G, et al. 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