大鼠蛛网膜下腔置管方法的改进

　　大鼠蛛网膜下腔置管方法，在镇痛及在脊髓层面相关领域中广泛应用，具有给药量小、给药位置固定等优点，自1976年Yaksh等发明后，广泛应用。但传统的大鼠蛛网膜下腔置管方法操作复杂、创伤大、难管理、大鼠术中死亡和术后感染发生率高。本实验改进传统的大鼠鞘内置管方法，操作简单，对大鼠损伤小，现将具体操作方法及体会报告如下。　　1材料与方法　　1.1实验动物健康雄性SD大鼠30只，体质量250一300g，由广西医科大学实验动物中心提供「动物合格证号:SCXK(桂)2009-0005〕。　　1.2实验试剂3.5%水合氯醛、盐酸利多卡因注射液(湖北宜昌人福药业有限公司，批号:20100412),青霉素钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号:20091128),0.9%氯化钠注射液(广东大家制药有限公司，批号:20100104),75%酒精消毒液、碘伏消毒液、亚甲蓝等。　　1.3实验器材实验动物固定台、20G静脉留置针(美国BD公司),25闪微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)、眼科剪、组织剪、有齿镊、持针器、弯钳、蚊式钳、手术刀、缝针、缝线。　　1.4实验方法　　1.4.1大鼠鞘管内置管方法:(1)大鼠分别称重，腹腔内注射3.5%水合氯醛10ml/kg麻醉。麻醉满意后取大鼠俯卧位，将其平置于动物固定台上，妥善固定四肢。摸清两侧骼峙，其水平连线为大鼠L。棘突。　　向上数3个间隙为手术切口中心，并做好标记。(2)剪毛、碘伏消毒。于背部正中线L3-4间隙处做长约2cm的皮肤纵切口，依次切开皮肤、浅筋膜，钝性分离L3及L、棘突周围肌肉，暴露L3-4棘突间隙。左手持弯钳提起下位棘突，右手以20G静脉留置针探查，穿破黄韧带及硬脊膜，以鼠尾突然出现侧摆或后腿抽动为成功标志，同时可见清亮的脑脊液外溢。经硬脊膜破口向头侧将20G静脉留置针的外套管全部置入(约2cm)，此时可见导管外露的头端内充盈清亮的脑脊液。(3)逐层缝合肌肉、浅筋膜、皮肤，缝合浅筋膜时将导管缝扎固定好。然后用0.90l0氯化钠注射液10闪冲洗导管，防止血栓或脑脊液堵塞导管。如果导管通畅，导管外露的头端用高压蒸汽灭菌的通用螺旋帽口封闭，防止脑脊液外溢。(4)术毕，用75%酒精再次消毒伤口，肌肉注射青霉素钠。台灯照射大鼠维持大鼠体温(35.011.0)C1一2h。所有置管后的大鼠均单笼饲养，每天位查有无脊髓神经损伤及局部感染表现。　　1.4.2蛛网膜下腔给药:术后第2天，确定无后肢功能障碍者，固定大鼠，25闪微量进样器连接20G静脉留置针外套管的头端，向蛛网膜下腔注射2%利多卡因25闪，若大鼠30s内出现双下肢麻痹、瘫痪症状，不能支撑身体，并在30min内恢复下肢活动能力的现象，提示导管位于蛛网膜下腔内，可以纳人实验。　　1.4.3灌注固定:术后第4天，腹腔注射3.5%水合氯醛10ml/kg麻醉，固定于冰上，蛛网膜下腔内注射20闪亚甲蓝以确认导管尖端位置。迅速打开胸腔，充分暴露心脏和主动脉，将灌注针头插人左心室直至主动脉，剪开右心耳。打开恒流泵以10ml/min的速度开始从心脏灌注生理盐水，待大鼠右心耳流出液体清亮无血，肝肠颜色泛白，表示灌注理想。换4%多聚甲醛灌注固定40一60min.　　2结果　　大鼠蛛网膜下腔置管操作时间为20一30min，平均为25.0minx30只大鼠均未出现因置管导致的死亡和肢体活动障碍，蛛网膜下腔注射2%利多卡因25闪,30只大鼠30s内均出现双下肢麻痹、瘫痪症状，钳夹双上肢躲避反射存在，而双下肢无反应，夹尾反射消失，在30min内恢复下肢活动能力。每天观察未见脊神经损伤、局部感染。大鼠蛛网膜下腔内注射20闪亚甲蓝，4%多聚甲醛灌注固定后，打开椎管，暴露脊髓，发现导管均位于蛛网膜下腔内。　　3讨论　　蛛网膜下腔置管术作为一种脊髓直接给药法，既可给药、又可收集脑脊液，在麻醉、镇痛、心血管调控的脊髓机制以及药物脊髓作用的研究中具有重要的价值。常见大鼠蛛网膜下腔给药方式主要有3种，分别为腰部穿刺给药伙经枕骨大孔蛛网膜下腔置管给药、腰部蛛网膜下腔置管给药。目前常用的Yaksh等报告的方法，采用PE10导管，自大鼠枕骨大孔插管到腰脊髓膨大，置管约7.5cm。蛛网膜下腔空间小，插人导管走行距离长，可能产生脊髓损伤，容易导致动物瘫痪或者死亡，置管成功率低，常需要大量实验动物才能保证实验的进行。为了减少脊髓的损伤，有学者采用直接从腰段切口或“管过针”技术置管人蛛网膜下腔，这样可以减少导管压迫脊髓的长度。尽管采用通过皮下隧道到头侧固定，然而导管近端不容易固定而滑出的问题仍难以解决。等提出在1'3-4棘突间隙置管的方法，但仍然发现存在问题:导管在蛛网膜下腔的长度较短，且由于PE10导管较细，没有合适缝扎的固定部位，因此，在大鼠活动时容易脱落。Yaksh等在置管前将PE10导管末端均匀拉伸，减少导管的直径和硬度，这样显著减少对脊髓的损伤。邹望远等用Microspinal导管代替PE10导管，因其柔软、导管上标有刻度，并且可以用微量注射器和Alzet微量泵注射给药，所以非常适合实验，取得较好效果。　　基于上述实验方法的缺陷，本实验在大鼠I'3-4棘突间隙置管方法的基础上进行了较大的改进，采用20G静脉留置代替传统的PE10导管。该方法有以下优势:(1)20G静脉留置针外套管均配有独立针芯，均经厂家灭菌处理后独立包装，规格适宜(外径:0.9mm，内径:0.65mm)，操作简单方便，避免了传统PE10导管需要分别裁剪，另配针芯，每次使用需要重新高压蒸汽灭菌等繁琐步骤;(2)价格低廉，更适合探索性实验和批量实验使用;(3)临床运用早已成熟，接输液端表面呈螺旋状，易于导管的逢扎固定，有效降低导管的脱落率。　　蛛网膜下腔置管术后大鼠分开单独饲养，避免互相撕咬，咬脱导管。蛛网膜下腔置管成功后考虑到手术对脊髓的急性影响，并不急于给药开始实验，而是在置管2d后开始给药，可以排除蛛网膜下腔置管因素对动物疼痛行为学的影响。　　综上所述，大鼠蛛网膜下腔置管，使用20G静脉留置针代替传统PE10导管，具有操作简单、对大鼠损伤小、术后恢复快等特点，值得在疼痛学动物实验研究中广泛推广。　　参考文献　　Yaksh TL,Rudy TA. Analgesia mediated by a direct spinal action of narcotics[J].Science,1976,(4 246):1357-1358.　　芮海涛,张庆国,徐世元. 大鼠蛛网膜下腔置管及背根神经节分离方法的改进[J].广东医学,2007,(12):1915-1917.doi:10.3969/j.issn.1001-9448.2007.12.010.　　林献忠,李继勇,陈冀衡. 大鼠经皮穿刺鞘内给药方法在疼痛基础研究中的应用[J].福建医科大学学报,2004,(02):185-186.doi:10.3969/j.issn.1672-4194.2004.02.021.　　Yaksh TL,Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space[J].Physiology and Behavior,1976,(06):1031-1036.　　Strkson RV,Kjrsvik K,Tjlsen A. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat[J].Journal of Neuroscience Methods,1996,(02):167-172.doi:10.1016/0165-0270(95)00164-6.　　Martin H,Kocher L,Chery-Croze S. Chronic catheterization in the rat with reduced length compression[J].Physiology and Behavior,1984,(01):159-161.　　Poon YY,Chang AY,Ko SF. An improved procedure for catheterization of the thoracic spinal subarachnoid space in the rat[J].Anesthesia and Analgesia,2005,(01):155-160.　　Yaksh TL,Grafe MR,Malkmus S. Studies on the safety of chronically administered intrathecal neostigmine methylsulfate in rats and dogs[J].Anesthesiology,1995,(02):412-427.doi:10.1097/00000542-199502000-00012.　　邹望远,郭曲练,蔡进. Microspinal导管在大鼠蛛网膜下腔置管中的应用[J].中国比较医学杂志,2006,(07):411-414.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2006.07.008.　　赖力英,杨旭,贺志军. 大鼠肝动脉插管给药途径的建立[J].中国比较医学杂志,2005,(04):235-236.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2005.04.014.