原发性癫疒间耐药的细胞和分子机制研究进展

原发性癫疒间耐药的细胞和分子机制研究进展作者：夏敏 武士京    作者单位：300070天津医科大学总医院神经内科    【关键词】  原发性癫疒间 耐药 细胞和分子机制    原发性癫疒间是指除遗传因素外不具有其他潜在病因的癫疒间。一部分药物治疗良好，仍有少部分药物治疗无效。其机制可能有多种：因长期用药或药物间的相互作用，药物代谢加快，不能达到有效的血药浓度；血-脑屏障（BBB）阻碍抗癫疒间药（AEDs）在脑内达到有效的药物浓度；药物作用靶点改变降低药物的敏感性。细胞色素P450（CYP450）家族变异、多药耐药蛋白（MDRP）表达增多和药物作用靶点改变分别从上述3方面影响药物发挥作用。现就以上3方面进行综述。1  药物代谢酶    药物代谢影响其血药浓度，最终改变靶器官内的药物含量。参与AEDs代谢的主要酶系是CYP450，其他代谢酶系有水解酶和葡萄糖醛酸化酶（UGTs）等。传统AEDs如苯巴比妥（PB）、苯妥英钠（PHT）、扑疒间酮（PRM）、卡马西平（CBZ）对CYP450（CYP1A2,CYP2A6,CYP2B,CYP2C,CYP3A）有广泛诱导作用；丙戊酸钠（VPA）是一种广谱肝酶抑制剂，可抑制经CYP2C9代谢药物（PHT，PB）、环氧化物（CBZ），抑制经UGTs代谢药物如拉莫三嗪（LTG）、唑尼沙胺（ZNS）。而新型AEDs如加巴喷丁（GBP）、左乙拉西坦（LEV）、噻加宾（TGB）、ZNS几乎没有肝酶诱导作用；托吡酯（TPM）和奥卡西平（OXC）可选择性抑制经CYP2C19代谢的药物［1］。机体对药物的反应与药物代谢酶（DMEs）基因多态性有关，如CYP2C9和CYP2C19基因在不同种族和个体具有单核苷酸多态性（SNP），与AEDs代谢活性有关。　　1.1  CYP2C9基因多态性 　　至今发现CYP2C9基因至少有24个等位基因（CYP2C9*1～24），不同的氨基酸残基导致酶代谢活性的差异。Robert等［1］发现白种人主要是CYP2C9*2和CYP2C9*3两种基因突变，是由CYP2C9*1编码区基因突变而致1个氨基酸置换（分别为Arg144Cys和Ile359Leu），这两种基因突变致酶代谢活性降低。van der等［2］ 观察了发现CYP2C9*2或CYP2C9*3基因型的患者需要PHT剂量比CYP2C9*1基因型少37%，且易出现不良反应。Keiko等［3］分析了263例日本人的CYP2C9基因，发现62例有变异，7例是罕见的基因突变，分别是CYP2C9*25～ 30;同时进行的离体研究发现：CYP2C9*25是无效等位基因，CYP2C9*26、*28、*30是有缺陷的等位基因。与*1相比，CYP2C9*26最大反应速度（Vmax）降低了90%，*28和*30 米氏常数（Km）增高了1倍，而Vmax降低了2倍。　　1.2  CYP2C19基因多态性 　　Joyce等［4］对CYP2C19弱代谢者基因分析发现了7种等位基因（*2～8），分别对其测序研究表明：*2是外显子5出现剪接突变，*3在外显子4出现1个终止密码子，其他无义突变包括*4出现1个启动子突变，*7在内含子5发生桥接突变，*5在血红素结合区出现1个氨基酸改变。与野生型CYP2C19*1相比，所有这些等位基因所编码蛋白质活性下降。2  MDRP    MDRP属于ATP结合盒（ABC）载体超家族，包括P-糖蛋白（PgP）、多药耐药相关蛋白（MRPs）和肺耐药蛋白等。PgP是相对分子质量为170 kDa的跨膜糖蛋白，表达于各种吸收与排泄器官中，亦表达于BBB。人类PgP由MDR1基因编码，作为药物外排泵，减少进入脑内的药物浓度。  　2.1  MDRP在脑内的分布 　　MDRP被认为是导致AEDs耐药的重要因素，在转运AEDs通过BBB中发挥重要作用。由于缺乏AEDs治疗有效的合适对照组，判断MDRP在癫疒间耐药中的角色较为困难。通过对外科手术切除的颞叶和海马组织的研究［5］发现,难治性癫疒间（RE）患者脑组织PgP在毛细血管内皮细胞和胶质细胞表达增多，比动静脉畸形高10倍，正常脑组织星形胶质细胞无PgP表达。Sisodiya等［6］报道皮质发育不良的RE患者手术切除的脑组织内皮细胞和血管周围星形胶质细胞PgP表达过度，推测可能与致疒间灶周围细胞外AEDs浓度降低有关。陈英辉等［7］报道RE患者脑组织PgP免疫阳性细胞分布及表达明显高于正常对照组，星形胶质细胞和血管内皮细胞均有大量的PgP表达。　　2.2  RE患者脑组织PgP表达增高的机制 　　RE患者脑组织PgP表达增高机制目前有以下几种学说：⑴MDR1基因多态性：Siddiqui等［8］对315例癫疒间患者MDR1 C3435T SNP基因分析显示，RE患者此区基因多为CC，药物治疗有效组和对照组多为TT。但这种多态现象并未改变氨基酸序列，且患者并未根据病因和综合征进行仔细分组，所以解释较困难。⑵癫疒间发作致PgP高表达：Rizzi等［9］发现急性海人酸点燃大鼠及电刺激海马致疒间大鼠的海马区MDR1 mRNA增高。郑雪平等［10］ 研究发现为RE患者外周血MDR1 mRNA表达上调是疒间性发作而非使用AEDs的结果。⑶AEDs诱导PgP表达增高：研究发现 PB可显著诱导PgP表达上调，PHT次之。Wang等［11］用马桑内酯（CL）制作颞叶癫疒间大鼠模型并给予AEDs治疗，发现癫疒间鼠PgP表达呈梯度水平（CBZ/VPA/PHT治疗后>未予治疗>注射CL后未被点燃>对照组）；表明点燃过程、重复发作及AEDs均可诱导PgP表达增高。　　2.3  PgP底物与AEDs关系 　　理论上疏水性的AEDs均可能为PgP的候选底物，离体试验表明PHT通过PgP转运。Stills等［12］比较4种传统AEDs（PB，PHT，CBZ，VPA）和4种新型AEDs（LTG，VGB，GBP，TPM），分别单药给予MDR1 M（-/-）鼠和野生鼠，4 h后发现两组血药浓度并无差别，但CBZ、LTG、GBP和TPM脑/血浓度比值显著高于野生鼠，提示上述药物可能是PgP的底物。微量渗析技术测定大鼠脑组织细胞外液的AEDs浓度证明，局部给予PgP抑制物维拉帕米可明显提高细胞外液PHT、CBZ、PB、及LTG浓度，提示上述药物可能是表达在BBB上的PgP的底物［13］。Erwin等［14］用特异的PgP抑制剂TQD作用于自发性发作鼠模型，发现给予治疗量的PHT 7 d仅能部分抑制其自发性癫疒间发作；但当给予PHT同时给予TQD时，几乎全部发作均能被控制。进一步证实了PHT是PgP底物，也为未来RE的治疗提供了方向。  3  药物作用靶点的改变　　AEDs进入脑组织后，结合在1个或更多的靶分子上才能调节神经元兴奋性以发挥作用。靶分子改变可导致作用于此靶点的AEDs药效下降而产生耐药。　　3.1  电压门控钠离子通道（ⅠNaT ） 　　作用于ⅠNaT 的AEDs有CBZ、PHT、LTG和TPM，VPA对ⅠNaT的作用较弱；ⅠNaT功能降低可能是癫疒间耐药的机制之一。Remy等［15］发现在点燃的癫疒间动物模型的海马CA1区神经元，CBZ对稳定期失活的ⅠNaT作用迅速降低,而在匹罗卡品所致的癫疒间模型和对CBZ耐药的颞叶癫疒间患者的齿状颗粒细胞中，CBZ的功能依赖性阻滞作用完全且长久的失效。癫疒间患者脑组织ⅠNaT敏感性改变可能是通道的亚单位结构改变，例如对AEDs不敏感的亚单位或亚单位联合体表达增多。　　许多AEDs是通过结合ⅠNaT的第4结构域、第6螺旋段调节ⅠNaT功能，进而使神经元兴奋性恢复正常。因此离子通道结合部位蛋白3级结构的改变也可导致耐药。婴儿重症肌阵挛癫疒间（SMEI）和伴热性发作的全身型癫疒间（GEFS+）患者对作用于ⅠNaT药物的耐药机制，与ⅠNaT的药物受体区和其他参与去极化-复极化过程的重要区的改变有关［16］。多数SMEI患者SCN1A基因有错义突变，致ⅠNaT蛋白缩短，使野生型电压依赖性的失活通道向超极化方向转换，减弱Na+ 电流。相反，GEFS+是由SCN1A和SCN1B点突变所致的一种良性表型，可增加Na+ 电流，药物治疗效果较好［17］。因此，通道蛋白3级结构改变参与耐药机制。　　3.2  其他离子通道 　　电压门控Ca2+通道可分为高阈值Ca2+（L-Ca2+）通道和低阈值Ca2+（T-Ca2+）通道。已证实GBP可特异结合于突触前膜L-Ca2+副α2δ亚单位，抑制其作用，减少神经递质的释放［18］。另外T-Ca2+通道与失神发作有关，治疗失神发作的乙琥胺抗癫疒间作用在于抑制丘脑神经元T-Ca2+通道异常放电［19］。　　H电流（IH）是超极化激活的混合阴离子电流，细胞复极时失活。IH可调节膜电阻、树突整合和稳定其他电位的多种功能，其特征是与对应的离子通道多位于树突而不是神经元的胞体。树突部位的IH可被LTG和GBP增强，减少树突的兴奋性，抑制神经元放电。对癫疒间动物模型的研究［20］发现内嗅区皮质神经元IH丧失，此种改变与LTG耐药之间的机制尚不清楚，但显著减少了将导致LTG药物作用的靶点。　　3.3  神经递质 　　γ-氨基丁酸（GABA）是人脑中重要的抑制性神经递质，与GABAA受体结合使该离子通道型受体开放，允许Cl-和少量的HCO-3通过，使突触后膜超极化而产生神经元突触后膜抑制效应。直接调节GABAA的药物包括苯二氮艹   卓类和巴比妥类。地西泮通过变构效应增强GABA与其受体结合增加Cl-电导。氨己烯酸是GABA的类似物，抑制GABA转氨酶致使脑内GABA浓度升高。TGB抑制GABA转运体GAT1，阻滞GABA的再摄取。　　在慢性癫疒间动物模型中发现作用于GABAA受体的药物活性下降。在匹罗卡品点燃癫疒间模型，其树突细胞GABAA受体对作用于苯二氮艹   卓受体区1的药物的敏感性下降，苯二氮类药物-氯氮艹   卓增强GABA介导的电导作用减弱，而选择性作用于苯二氮艹   卓受体1的激动剂的唑吡坦对GABA的增强作用显著下降［21］。这些结果提示在临床用苯二氮艹   卓治疗癫疒间患者效果不显著也可能是与上述原因有关。　　3.4  药物作用靶点改变的分子机制 　　离子通道亚单位转录过程中发生变化是药物作用靶点改变的主要机制。在癫疒间动物模型与癫疒间患者中均发现癫疒间发作可致某些特定的离子通道亚单位转录发生变化因而神经元细胞膜离子通道或亚单位复合体密度变化［22］。Bernard等［23］发现癫疒间发作还会引起离子通道蛋白翻译后修饰变化，如蛋白转运或与靶点结合、磷酸化或糖基化发生改变，因此可能影响对药物的敏感性。4  展望   了解癫疒间患者CYP450的不同基因亚型，可推测所给予的AEDs药代特点、疗效，避免严重的不良反应。研究RE与MDRP关系，应用高特异性的MRP抑制剂或MRP亚基因敲除鼠研究更具有针对性。现在对AEDs的研究大多用急性癫疒间动物模型，这些动物的离子通道和受体还没有慢性变化，并不能很好的代表人类癫疒间的复杂变化。因此筛选作用于离子通道的新型AEDs应选择慢性癫疒间模型和癫疒间患者脑片。药物基因组学研究［24］可确定癫疒间患者的主要药物转运体、DMEs、离子通道等重要基因的多态现象，有助于鉴别出哪些患者将成为RE，并指导治疗。【参考文献】［1］Robert S,Timothy B,Suson G,et al.Pharmacogenetics，2001,11:803.［2］van der WJ,Steijns M,van Weelden MJ,et al.Pharmacogenetics，20-01,11:287.［3］Maekawa K,Fukushima-Uesaka H, Tohkin M. 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