结节性硬化症TSC2基因突变的分析

结节性硬化症TSC2基因突变的分析作者：赵玉武    作者单位：200233上海交通大学附属上海第六人民医院神经内科     【摘要】  目的 分析结节性硬化症（TSC）致病基因TSC2突变方式。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术，对TSC一家系4例TSC患者（其中1例疑似）、1例散发性TSC患者外周血TSC2的41个外显子进行检测，并与家系中健康对照组和无血缘关系健康对照组进行比较。结果 此1家系中4例TSC患者（包括1例疑似）的TSC2基因外显子33发生了1346丝氨酸（S）→脯氨酸（P）（4037T→C）错义突变,1例散发性TSC患者及两健康对照组未检测到TSC2基因突变。结论 在TSC患者中TSC2外显子33错义突变（1346S→P,4037T→C）是一种尚未报道的新发现的基因突变方式。     【关键词】  结节性硬化症 TSC2基因 基因突变    Analysis of  TSC2 gene mutational  in tuberous sclerosis complex  　　ZHAO Yu-wu, SUN Xiao-jiang, ZHENG Hui-min, et al.　　Department of Neurology, Shanghai Sixth Hospital Affiliated to  Shanghai  Jiaotong   University, Shanghai 200233, China      Abstract：Objective  To analyse the mutation of pathogenic gene TSC2  in  tuberous sclerosis complex （TSC）. Methods   Using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism（PCR-SSCP）, all the 41 exons of TSC2 gene  were analyzed in  4 TSC  cases（include 1 suspect case） from one family and 1 sporadic TSC case ,and  compared with the kin familial controls and kinless normal controls. Results  Missense mutation on exon33 1346S→P （4037T→C） of TSC2  was found in 4 familial cases, and  no mutation of TSC2 gene was found in the sporadic case and all the health controls. Conclusion  Missense mutation on exon33 （1346S→P,4037T→C）is a new discovery in TSC2 gene of patients with TSC.       Key words：tuberous sclerosis complex；TSC2 gene；gene mutation    结节性硬化症（TSC）是常染色体显性遗传性疾病。1987年Fryer等［1］首先发现TSC的第一个致病基因位点位于9q34区，命名为TSC1；1992年Kandt等［2］发现TSC的第二个致病基因,位点在16p13.3，命名为TSC2。近年来研究发现TSC基因突变类型及方式复杂。本研究对1个TSC家系中4例患者及1例散发性TSC患者TSC2基因的全部41个外显子进行检测，拟发现我国TSC患者基因变异特点。1  对象与方法　　1.1  对象　　1.1.1  TSC家系 　　（1）先证者：女，29岁，汉族。因“发作性抽搐23年，面部红褐色丘疹17年”于2003年6月20日就诊于山东省癫疒间病医院。患者6岁出现癫疒间发作，11岁出现“面部小疙瘩”，并逐渐增多。初中文化，成绩一般。查体：神志清晰，面部及鼻翼两侧密布棕色及红棕色半球形小结节，针帽及绿豆大小，质地较硬；背部及腰部6处大小不一的色素脱失斑及鲨鱼皮样改变；眼底正常。肝肾B超正常；头颅CT示室管膜下有4个钙化结节；诊断：TSC。（2） 先证者之父，51岁。先证者确诊后，经相关医院提示于2003年10月6日就诊于长海医院。患者26岁时出现癫疒间发作，2年前发现“眼周皮肤颜色变黑”。文化程度小学三年级，成绩一般。检查：眼周皮肤颜色灰暗，双眼睑下及颈部可见针帽大小纤维疣，背部及上臀部8处大小不一的色素脱失斑及鲨鱼皮样改变；眼底正常。肝肾B超正常；头颅CT示皮质及室管膜下有2个钙化结节；诊断：TSC。（3）先证者之弟，25岁。先证者确诊后，经相关医院提示于2003年10月6日就诊于长海医院。患者19岁时出现癫疒间发作，21岁时出现“面部小疙瘩”。高中文化，成绩一般。检查：面部及鼻翼两侧散在棕色及肉色半球形小结节，针帽及绿豆大小，质地较硬；背部及腰部4处大小不一的色素脱失斑及鲨鱼皮样改变；眼底正常。肝肾B超正常；头颅CT示室管膜下有4个钙化结节；诊断：TSC。 （4）先证者弟之子，2岁4个月。出生时发现背部1处色素脱失斑；1岁2个月时出现癫疒间发作；发育及智能状况正常。检查：背部及左臀部3处色素脱失斑；眼底正常。心脏、肝肾B超正常；头颅CT未发现异常。根据1998年TSC诊断标准为疑似TSC。家系谱图见图1。　　1.1.2  散发性患者 　　男，12岁，汉族。因“双面部红褐色丘疹4年”于2003年11月8日就诊于长海医院，患儿8岁时出现“面部小疙瘩”，并逐渐增多。小学4年级，成绩一般。无癫疒间发作史；无TSC家族史。检查：面部鼻翼两侧密布红色及红棕色半球形小结节，针帽及绿豆大小，质地较硬，压之不褪色，背部及上臀部6处大小不一色素脱失斑及鲨鱼皮样改变，眼底正常。 B超示左肾血管平滑肌脂肪瘤；头颅CT示皮质下及室管膜下有6个钙化结节；诊断：TSC。　　1.1.3  家系健康对照组 　　与患者有血缘的健康家系成员，男7人，女3人；年龄4～48岁，平均29岁。　　1.1.4  健康对照组 　　与患者无血缘关系的汉族健康对照者，男7人，女3人；年龄12～52岁，平均31岁。　　1.2  方法　　1.2.1  DNA提取 　　取研究对象外周血5 ml，抗凝,血液DNA提取试剂盒（上海华舜生物工程公司）提取基因组DNA作为聚合酶链式反应（PCR）模板。　　1.2.2  TSC2 基因PCR 　　TSC2基因共41个外显子，引物设计根据文献［5］。外显子39、40太短，合成一对引物。PCR反应体积25 μl，Taq酶5 U/ml（美国Promega公司）。反应条件：95℃预变性5 min，然后95℃、 54℃、72 ℃分别变性40 s，循环35次，55℃退火30 s，72 ℃延伸6 min。取PCR扩增产物4 ml，加入3 ml上样缓冲液（上海华舜生物工程公司），95℃变性8 min后迅速置冰水中骤冷，迅速上样于琼脂糖凝胶，15℃ 500 V 电压3 h，至溴酚兰泳出胶外10～15 min停止电泳，银染15 min后显色。　　1.2.3  目的基因的纯化、连接及序列测定  　将单链构象多态性（SSCP）检测异常的基因相应的外显子PCR扩增产物电泳回收，采用PCR纯化试剂盒（美国Qiagen公司）回收DNA,PCR再次验证后测序。目的基因由上海申工生物工程技术公司测序。登录http://www.ncbi.nih.niv.gov 网站，利用BLAST Program进行数据库同源性比较。若有突变，在家系其他成员及正常人中进行证实性测序分析。2  结  果　　2.1  SSCP结果 　　家系中3例确诊及1例疑似患者的TSC2外显子33出现异常电泳条带（图2），余40个外显子无异常；家系健康对照组、散发性TSC患者及健康对照组未发现异常电泳条带。　　2.2  DNA序列测定结果 　　见图3。将DNA序列进行数据库同源性比对发现，家系中3例确诊及1例疑似TSC患者TSC2外显子33出现核苷酸4037T→C置换，导致氨基酸改变为1346丝氨酸（S）→脯氨酸（P），为错义点突变。1例散发性患者、家系健康对照组及健康对照组TSC2基因外显子33序列分析未发现同样的变化。3  讨  论    TSC是依靠临床表现可作出诊断的遗传性疾病之一。按照TSC临床诊断标准［3，4］，本研究中4例为确诊TSC患者，1例为临床疑似病例。    TSC基因突变类型及方式复杂，国外研究［5，6］表明，TSC1突变有7类，130种突变方式；TSC2有8类，357种突变方式，且不断有新的突变类型及方式被发现，为此建立了TSC基因突变数据库（http://zk.bwh.harvard.edu/projects/tsc-database/index）。国内冯建华等［7］对28例TSC患者TSC1或TSC2基因进行了完整的检测分析;也有学者对TSC1外显子4进行了检测 ［8］。本研究对5例TSC患者的TSC2基因全部41个外显子进行了检测，其中1例为散发，4例来自于一个家系。结果发现，在家系患者中，3例确诊TSC及1例疑似TSC患者TSC2基因外显子33发生了点突变，为核苷酸4037T→C置换，氨基酸改变为1346S→P的一种错义突变。1例散发性患者、家系健康对照组及健康对照组未检测到同样的变化。经文献检索［5，6］及登录TSC基因突变数据库和人类基因变异数据库网站（Human Gene  Mutation Databases，http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/search/120735.html,2007年3月）未发现TSC2中该变异方式报道。这是一种在TSC患者中新发现的TSC2基因突变方式。　　本研究新发现的4037T→C点突变，是一种致病性基因突变方式，发生突变的4例TSC患者来自于一垂直家系，而在其他家系成员和健康对照组、散发TSC患者中未检测到同样的变化，因此多态现象的可能性小。另外，在已报道［5，6］的TSC2基因突变中，88%是基因一些小的改变，点突变是最常见的类型。TSC2其他外显子T→C导致氨基酸S→P的致病性突变方式既往报道有2种，Diabora等［9］发现1723S→P（5167T→C）错义突变；日本学者报道一家系9例TSC患者，均检测到TSC2的1036S→P（3106T→C）错义突变，证实S→P是一种致病性突变方式。丝氨酸（S）是一种具有羟基的活性氨基酸，而脯氨酸（P）是一种保守氨基酸。另有研究［10,11］证实，TSC1和TSC2在细胞质内形成蛋白复合体而发挥效应,生长因子可以使TSC2在丝氨酸残基处磷酸化，影响它和TSC1的结合，可能是调节TSC1/TSC2蛋白质复合物形成的关键 。这些发现进一步表明丝氨酸在TSC2表达的蛋白的功能中具有重要作用。    本研究发现，1例临床疑似TSC患儿存在TSC2基因突变，该患儿得以确诊；分子生物学研究为表型不完全、不能满足临床确诊TSC条件的患者提供了可靠的诊断依据。在1例散发性患者中，未检测到TSC2基因的变异，推测可能突变位于TSC1基因，或为假阴性。【参考文献】　　［1］Fryer AE ，Chalmers A, Connor JM, et al. 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