不同脑温状态下地西泮对大鼠脑缺血组织氨基酸及自由基的影响

不同脑温状态下地西泮对大鼠脑缺血组织氨基酸及自由基的影响作者：邱小鹰    作者单位：545001柳州，广西医科大学第五附属医院神经内科    【摘要】  目的 探讨不同脑温状态下地西泮对大鼠脑缺血组织谷氨酸（Glu）、γ氨基丁酸（GABA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）及丙二醛（MDA）的影响。方法 建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，诱导目标脑温，测定轻度高温、常温、亚低温状态下各组脑缺血组织Glu、GABA、SOD、GSHPx及MDA含量。结果 （1）与常温假手术组比较，常温脑缺血对照组及常温地西泮组Glu、MDA水平显著增高（均P<0.001），SOD、GSHPx水平显著降低（均P<0.001），GABA在常温脑缺血对照组差异无统计学意义（P>0.05），在常温地西泮组则显著增高（P<0.01）。（2）与常温脑缺血对照组比较，常温地西泮组GSHPx显著增高（P<0.001），MDA显著降低（P<0.001），而Glu、GABA、SOD差异均无统计学意义（均P>0.05）。（3）与常温地西泮组比较，轻度高温地西泮组Glu、MDA显著增高（均P<0.001），SOD、GSHPx显著降低（均P<0.001），GABA差异无统计学意义（P>0.05）；亚低温地西泮组Glu、MDA显著降低（P<0.01～0.001），GABA、SOD、GSHPx显著增高（均P<0.001）。结论 亚低温状态下，地西泮显著上调GABA水平，有利于地西泮“抑制性保护”机制的建立，从而增强地西泮的神经保护作用。    【关键词】  脑缺血 脑温 地西泮 氨基酸 自由基    Effects of diazepam under different cerebral temperature on amino acid concentration and oxyradical in cerebral ischemia tissue of rat  QIU Xiaoying, WANG He, CHEN Hanming, et al. Department of Neurology, Fifth Affiliated Hospital of Guangxi Medical College, Liuzhou 545001 China    Abstract：Objective  To reseach the effects of diazepam under different cerebral temperature on the concentration of  glutamate（Glu）, γaminobutyric acid (GABA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase(GSHPX) and malonaldehyde(MDA) in cerebral ischemia  tissue of rat. Methods  The modle of cerebral middle artery occlusion reperfusion of rats was established  to induce the target cerebral temperatue.The concentration of Glu, GABA, SOD, GSHPX and MDA were detected in mild hyperthermia, ordinary temperature and subhypothermia groups respectively. Results  (1)Compared with the shamoperation group under normal temperature,the concentration of Glu, MDA had increased obviously in the control group of  focal cerebral ischemia and the group using diazepam under normal temperature (all P<0.001),but the concentration of SOD, GSHPx had decreased markedly (all P<0.001).There was not statistically significant difference in concentration of GABA in control group under normal temperature of ischemia(all P>0.05),but  the concentration of GABA had increased markedly in the groups of normal temperature using diazepam (P<0.01). (2)Compared with the control group under normal temperature ,the activity of GSHPx in the groups of normal temperature using diazepam had increased obviously (P<0.001), the concentration of MDA decreased markedly(P<0.001), but there was not statistically significant difference in concentration of  Glu, GABA and SOD (all P>0.05).(3)Compared with the control group using diazepam under normal temperature,the concentration of Glu and  MDA increased obviuosly(all P<0.001) and the activity of SOD, GSHPx decreased markedly (all P<0.001)in the groups of mild hyperthermia using diazepam, there was not statistically significant difference in concentration of GABA (P>0.05).The concentration of Glu and  MDA in the groups of hypothermia using diazepam was lower markedly (P<0.01～0.001), while the concentration of GABA, SOD and  GSHPx were higher obviously(all P<0.001). Conclusions  Under subhypothermia, diazepam can be upregulation  markedly the level of GABA, which may benifit the diazepams “inhibitory protection” and  enhance the neuroprotective effect of diazepam.    Key words：focal cerebral ischemia；cerebral temperature；diazepam；amino acid；oxyradical   近年来，人们提出了“抑制性保护”的概念［1，2］，使γ氨基丁酸(GABA)、苯二氮艹卓受体及其激动剂在脑缺血再灌注损伤中的作用受到重视。地西泮作为苯二氮艹卓受体完全激动剂可影响脑温，脑温对地西泮的神经保护作用也产生影响［3］。为了进一步探讨不同脑温状态下地西泮对大鼠脑缺血组织氨基酸及自由基的影响，本实验观察轻度高温、常温、亚低温状态下地西泮对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤组织谷氨酸（Glu）、GABA、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）及丙二醛（MDA）含量的影响。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物与分组  健康雄性Wistar大鼠40只，质量250～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验动物被随机分为5组，即常温假手术组、常温脑缺血对照组、常温地西泮组、轻度高温地西泮组、亚低温地西泮组，每组8只。    1.1.2  主要试剂与仪器  Glu、GABA检测主要使用：Gilson 116型高效液相色谱仪（HPLC），荧光检测器，邻苯二甲醛、LGlu、GABA 及内标高丝氨酸（均为Sigma 公司提供），国产分析纯，0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH=6.8）。SOD、GSHPx、MDA检测主要使用：SOD试剂盒、硫代巴比妥酸（TBA）等（分别为南京建成生物工程研究所、上海生化试剂厂产品），722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂产品）。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作  参考改良Nagasawa方法［4］，制备大鼠左侧大脑中动脉缺血2 h/再灌注2 h线栓模型。假手术组不栓塞动脉，其余操作同手术组。    1.2.2  脑温监控  实验中采用加温及脑温调节装置。脑温用颞肌温度间接反映。将测温探头包埋入动物左侧颞肌深部贴近骨外膜并与测温仪（半导体氧化物温度传感器）连接，连续监测。脑温的升降及维持采用60 W白炽灯正中移动距离头部加温和调节自动双控颅脑降温仪来完成。大脑中动脉闭塞即刻诱导目标脑温至实验结束，诱导时间为10 min。脑温维持在39～39.5℃者为轻度高温组，36.5～37℃者为常温组，32～32.5℃者为亚低温组。    1.2.3  给药方法  轻度高温、常温、亚低温地西泮组分别在脑缺血前30 min及脑缺血2 h再灌注即刻分两次给予地西泮（10 mg/kg，腹腔注射给药），常温假手术组和常温脑缺血对照组分别给予腹腔注射相同次数和剂量的0.9%氯化钠注射液。    1.2.4  氨基酸、抗氧化酶和脂质过氧化物检测  各组动物实验结束时迅速断头，冰盘上取出全脑，采集左侧大脑皮质，置于-70℃低温冰箱待测。制备脑皮质匀浆（称湿重），离心沉淀后取上清液。其中左侧大脑额顶部皮质标本采用HPLC荧光法检测Glu、GABA含量；左侧大脑颞顶部皮质标本采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，采用5.5′二硫对硝基苯（DTNB）直接显色法测定GSHPx活力，采用TBA分光光度法测定MDA含量。    1.2.5  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析。Glu、GABA、SOD、GSHPx等4个指标的数据方差齐性检验结果表明方差齐，各组数据两两比较应用最小差异法；MDA的数据方差齐性检验结果表明方差不齐，各组数据两两比较应用Dunnett t检验。2  结  果    各组大鼠Glu、GABA、SOD、GSHPx、MDA含量比较  见表1。与常温假手术组比较，常温脑缺血对照组及常温地西泮组Glu、MDA含量显著增高（均P<0.001），SOD、GSHPx活力显著降低（均P<0.001），GABA含量在常温脑缺血对照组差异无统计学意义（P>0.05），在常温地西泮组则显著增高（P<0.01）。与常温脑缺血对照组比较，常温地西泮组GSHPx活力显著增高（P<0.001），MDA含量显著降低（P<0.001），而Glu、GABA、SOD差异均无统计学意义（均P>0.05）。与常温地西泮组比较，轻度高温地西泮组Glu、MDA含量显著增高（均P<0.001），SOD、GSHPx活力显著降低（均P<0.001），GABA含量差异无统计学意义（P>0.05）；亚低温地西泮组Glu、MDA含量显著降低（P<0.01～0.001），GABA、SOD、GSHPx显著增高（均P<0.001）。 表1  各组Glu、GABA、SOD、GSHPx、MDA含量比较 注：与常温假手术组比较*P<0.001,**P<0.01；与常温脑缺血对照组比较△P<0.001；与常温地西泮组比较▲P<0.001，▲▲P<0.013  讨  论    脑缺血再灌注过程中Glu释放过多，细胞内Ca2+超载，氧自由基产生过多，脂质过氧化形成过多的终产物MDA。Glu过度释放和氧自由基产生增加形成恶性循环，同时伴抗氧化酶大量消耗，对神经细胞产生“兴奋毒性”损伤效应。内源性GABA及抗氧化酶作为保护性因子，可抑制脑缺血诱发的Glu过度释放、氧自由基过多产生及脂质过氧化。    GABA是脑内最重要的抑制性氨基酸，自由基产生过多可影响GABA释放，黄嘌呤氧化酶加黄嘌呤可诱发GABA 释放，SOD加过氧化氢酶则减少GABA释放［5，6］。脑组织内GABA与Glu的合成、释放维持着兴奋性神经递质与抑制性神经递质间的动态平衡，“抑制性保护”机制存在相应的生化物质基础［2］。GABA对抗Glu“兴奋毒性”、实现“抑制性保护”的作用与神经细胞GABA受体上的苯二氮艹卓结合位点有关。    地西泮是苯二氮艹卓受体完全激动剂，可使GABA（活性）增加，阻止缺血神经细胞死亡，对缺血神经细胞有保护作用［3，7］。高温状态可增加GABA分泌型神经细胞的易损性，导致兴奋性/抑制性神经细胞分泌失衡，加重缺血性脑损伤，亚低温状态则有利于保护缺血神经细胞。脑缺血时，给予地西泮可降低脑温，从而降低脑缺血后的高反应性［7］，脑温也可对地西泮的神经保护作用产生影响［3］。预防性给予地西泮可使缺血脑组织Glu明显降低，GABA明显增高，对缺血脑组织起保护作用 ［2］。    近年研究 ［8］证实，亚低温（32～34℃）对脑卒中和脑外伤有显著脑保护作用。本实验结果表明：（1）常温状态下，与假手术组比较，脑缺血对照组Glu、MDA水平增高，SOD、GSHPx水平降低，GABA水平没能上调；常温状态下给予地西泮干预，GABA水平及GSHPx水平分别高于假手术组及脑缺血对照组，MDA水平低于脑缺血对照组，地西泮没能显著上调常温脑缺血大鼠的GABA水平，可能提示：脑缺血时，常温状态下地西泮对修复兴奋性/抑制性因子的失衡具有一定作用，这种作用可能有限。（2）在轻度高温、常温、亚低温3种状态下，分别给予地西泮干预，与常温地西泮组比较，轻度高温地西泮组Glu、MDA水平增高及SOD、GSHPx水平降低更明显，轻度高温状态下地西泮不能上调GABA水平，可能提示：脑缺血时，轻度高温状态不利于地西泮修复兴奋性/抑制性因子的失衡，不利于地西泮降低Glu“兴奋毒性”相关的生化物质基础；亚低温地西泮组Glu、MDA水平降低及GABA、SOD、GSHPx水平增高更明显，亚低温状态下地西泮显著上调GABA水平，可能提示：脑缺血时，亚低温状态有利于地西泮修复兴奋性/抑制性因子的失衡，有利于地西泮降低Glu“兴奋毒性”相关的生化物质基础。    综上所述，地西泮的神经保护作用可能受脑温影响，轻度高温状态下，地西泮不能上调GABA水平，不利于地西泮“抑制性保护”机制的建立；常温状态下，地西泮上调GABA水平的作用有限；亚低温状态下，地西泮能显著上调GABA水平，有利于地西泮“抑制性保护”机制的建立，从而增强地西泮的神经保护作用。【参考文献】  ［1］Hall ED, Fleck TJ, 0ostveen JA. 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