吗啡耐受大鼠背根神经节磷酸化ｐ３８ ＭＡＰＫ的表达

　　作者：陈宇,崔宇,刘卫锋,张旭宇,李芳,冯鉴强　　作者单位：中山大学1.附属第一医院麻醉科，2.中山医学院生理学教研室， 广东 广州510080

　【摘要】 观察蛛网膜下腔(鞘内)慢性注射吗啡是否激活背根神经节(DRG)神经元，使其p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平发生改变。 【方法】 通过对成年雄性SD大鼠连续7 d鞘内注射吗啡15 μg而建立吗啡耐受的动物模型，或连续7 d在吗啡注射前30 min预先鞘内注射p38 MAPK抑制剂SB203580 10 μg，用50 ℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果，并用免疫组织化学法观察DRG 磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表达变化。【结果】 慢性鞘内注射吗啡7 d后，吗啡镇痛作用明显下降(P < 0.001)，吗啡耐受形成;而SB203580预处理可明显抑制吗啡耐受的形成(P < 0.001);免疫组织化学染色显示脊髓DRG p-p38 MAPK表达明显上调(P < 0.01)，且以小、中型神经元增加为主。【结论】 鞘内慢性注射吗啡可激活脊髓DRG小型和中型神经元，使其p38 MAPK磷酸化水平增加，这可能是吗啡耐受的机制之一。

　　【关键词】 吗啡耐受; 背根神经节; 磷酸化p38 MAPK; 大鼠

　　Expression of Phosphorylated-p38 MAPK in Dorsal Root Ganglion Neuronsin Morphine Tolerance in RatsCHEN Yu， CUI Yu， LIU Wei-feng， ZHANG Xu-yu， LI Fang， FENG Jian-qiang　1. Department of Anesthesiology， The First Affiliated Hospital， 2. Department of Physiology of Zhongshan Medical College，Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China　Abstract： 【Objective】 To investigate p38 mitogen-activated protein kinases (p38 MAPK) activation (phosphorylation) in the dorsal root ganglion (DRG) in morphine tolerance. 【Methods】 Morphine tolerance was induced by intrathecal administration of 15 μg morphine for 7 consecutive days and p38 inhibitor SB203580 (10 μg) was intrathecally administered 30 min before morphine to investigate the role of p38 in morphine tolerance. The analgesia effect was assessed with the tail-flick behavior test in hot-water (50 ℃) and the expression of phosphorylated p38 MAPK (p-p38 MAPK) in the DRG was investigated with immunohistochemistry. 【Results】 Chronic morphine treatment for 7 days led to significant reduction of analgesic effect and pretreatment with SB203580 (10 μg) attenuated morphine tolerance. Immunohistochemistry results showed that p-p38 expression was significantly upregulated in the DRG and was increased significantly in both small- and medium-sized neurons. 【Conclusions】 Chronic intrathecal morphine injection could activate small- and medium-sized DRG neurons. The upregulation of p-p38 in DRG might be the mechanism underlying morphine tolerance.

　　Key words： morphine tolerance; dorsal root ganglion; phosphorylated p38 MAPK; rats

　　吗啡是目前常用的强效镇痛药物，临床上广泛用于治疗各种急慢性疼痛，但病人长期使用吗啡会导致对吗啡镇痛作用的耐受，主要表现为镇痛作用下降及持续时间缩短、疼痛过敏、停药后疼痛加剧等，严重影响了治疗效果。虽然大量研究提示吗啡耐受形成与病理性疼痛可能存在相同的细胞机制[1]，与痛觉敏感性增加有关[2]，然而目前吗啡耐受的机制仍不清楚。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases， MAPK)可以将细胞外的信号传导至细胞内引起细胞内转录和翻译后反应，包括p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase， ERK)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase， JNK)和ERK5等成员。近期研究表明中枢神经系统的神经元和小胶质细胞内p38 MAPK激活即p38 MAPK磷酸化参与了病理性疼痛的产生[3]，但MAPK通路在吗啡耐受中的作用的探讨则非常有限。我们既往的研究发现脊髓小胶质细胞激活参与了吗啡耐受的形成[4]，而作为初级痛觉传递神经元的脊髓背根神经节(dorsal root ganglion， DRG)神经元是否参与了吗啡耐受则未见报道。本研究旨在大鼠模型中观察蛛网膜下腔(鞘内)慢性注射吗啡形成吗啡耐受是否与DRG神经元p38 MAPK激活有关，从而探讨吗啡耐受的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　清洁级Sprague-Dawley (SD) 成年雄性大鼠78只，体质量250 ～ 280 g，由中山大学北校区动物中心提供(国家级动物实验中心)。于12 h光照-黑暗循环、安静环境下单笼饲养，自由饮水摄食。室温(24 ± 0.2) ℃。

　　1.2 鞘内置管

　　大鼠适应饲养环境1周后开始实验。腹腔注射苯巴比妥钠(35 ～ 45 mg/kg)麻醉大鼠后，纵向切开第5腰椎(L5)间隙水平皮肤，分离椎旁肌，暴露L5间隙。8号针头穿刺，置入充满生理盐水的PE10聚氯乙烯导管(BD，USA)，见管腔中有清亮液体返流证实导管位于蛛网膜下腔后，将导管朝头端方向插入2.5 ～ 3.0 cm，使导管尖端位于脊髓腰膨大水平，封闭导管外口。逐层缝合肌肉与皮肤，并把外露于皮肤的导管妥善固定于腰部。术后第1天，通过置入导管以微量注射器注入20 g/L利多卡因5 μL，随后注入无菌生理盐水7 μL 冲管，即时出现双侧后肢瘫痪的大鼠被认为导管放置到位。术后出现后肢或尾部瘫痪、运动功能障碍或导管位置不到位的大鼠从实验中排除并立即注射过量苯巴比妥钠处死。

　　1.3 行为学测试

　　行为学测试时间为每天12：00-16：00。将大鼠放入容积为22 cm × 6.5 cm × 22 cm的塑料容器中，大鼠可以在容器中自由前后活动。大鼠完全适应容器的环境后以热水甩尾法测定痛阈。将大鼠尾部末端1/3迅速放入恒温的(50 ± 0.2) ℃热水中，用秒表记录从大鼠尾部入水到尾巴迅速甩离水面的时间，此时间为大鼠热水甩尾潜伏期(s)。为避免损伤，大鼠尾部在热水中停留最长时间设为15 s(cut-off time);如果15 s内不甩尾则将大鼠尾部撤离热水，将潜伏期定为15 s。按照上述方法连续测定3次，每次间隔2 min，3次潜伏期的平均值确定为痛阈值。

　　置管成功的大鼠恢复5 d后行痛阈值测试，随机分成生理盐水组(Saline)、吗啡耐受组(Morphine)及SB + 吗啡组(SB + Morphine)。生理盐水组每天鞘内注射生理盐水10 μL，吗啡耐受组每天鞘内注射盐酸吗啡15 μg (10 μL， 青海制药有限公司)，SB + 吗啡组在每天鞘内注射吗啡前30 min鞘内给予10 μg (10 μL) p38 MAPK阻断剂SB203580 (ALEXIS， San Diego， USA)。连续鞘内注射7 d并于鞘内注射的第1、3、5、7天行痛阈值测试。每次鞘内注射前及注射后30 min分别测定甩尾阈值。注射前为基础阈值(baseline latency)，注射后为镇痛阈值(drug-induced latency)，计算求得%MPE(percent of maximal potential effect，rMPE)[4]。

　　1.4 免疫组织化学

　　第7天行为学测定结束后注射苯巴比妥钠(100 mg/kg)处死大鼠。迅速行升主动脉插管，冰冷生理盐水快速灌注2 min后改为预冷的40 g/L多聚甲醛溶液灌注40 min。取腰4、5背根神经节，置入40 g/L多聚甲醛溶液，4 ℃固定2 h;转入150 g/L蔗糖溶液，沉底;再转入300 g/L蔗糖溶液，4 ℃放置48 h。-22℃下使用T9100冰冻切片机(Leika，Germany)行冰冻切片，片厚15 μm，行免疫荧光染色。步骤如下：加100 μL TBS于组织切片，室温浸泡30 min;加TBS/Triton，10 min × 2次;30 ml/L正常羊血清封闭1 h;倾去羊血清加入1：400兔抗大鼠p-p38 MAPK多克隆抗体(Cell signaling Technology，USA)，4 ℃孵育过夜;TBS冲洗10 min;TBS/Triton冲洗10 min × 2次;加入Cy3标记的1：400羊抗兔荧光二抗，室温避光孵育2 h;TBS冲洗10 min × 3次;Olympus荧光显微镜(BX51，Tokyo，Japan)下观察并照相，放大倍数为 × 20。

　　生理盐水组及吗啡耐受组每时间点各取4只大鼠，每只大鼠取5张DRG组织连续切片，计数切片中p-p38 MAPK阳性细胞的数量。用图像分析软件(KONTRON， IBAS 2.0， Germany)测量每个阳性细胞的面积值，根据文献将神经元按面积大小分类为[5]：小型神经元 < 600 μm2;中型神经元600 ～ 1 200 μm2;大型神经元 > 1 200 μm2。

　　1.5 统计学分析

　　实验结果以均数 ± 标准差(x ± s)表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。组间rMPE值以连续性重复测量方法进行比较，并以单因素方差分析比较组间及组内各时间点间的差异;各组大鼠不同类型的DRG p-p38 MAPK阳性细胞值以单因素方差分析比较。P < 0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　行为学测试结果，鞘内注射生理盐水及单纯注射SB203580后痛阈值与基础阈值相比差异没有统计学意义(P > 0.05)，表明生理盐水及SB203580不产生任何镇痛作用。第1天给予大鼠鞘内注射吗啡(15 μg)可以产生最大的镇痛作用[rMPE = (89.97 ± 1.06)%]。然而，连续鞘内注射吗啡第3天，吗啡镇痛作用开始明显下降[rMPE = (71.76 ± 2.00)%]，与第1天相比P < 0.001，表明耐受开始形成。随着注射时间的增加，吗啡镇痛作用进一步减弱，至第7天时吗啡组rMPE(15.15 ± 0.87)%已接近生理盐水组(-0.84 ± 0.94)%。虽然在第7天吗啡仍有镇痛作用，但吗啡镇痛作用的变化趋势表明至第7天时大鼠对吗啡镇痛作用已经形成明显的耐受。在SB + 吗啡组，每次注射吗啡前30 min给予p38 MAPK阻断剂SB203580(10 μg)则能够明显抑制耐受的形成：鞘内注射第1天的rMPE为(93.97 ± 0.93)%;鞘内注射第7天时其rMPE为(64.8 ± 2.1)%，与吗啡组相比仍能够产生明显的镇痛作用(P < 0.001，图1)。

　　免疫荧光染色结果，鞘内注射前(0 d)大鼠DRG少量神经元呈p-p38 MAPK阳性反应(29.42 ± 0.78)，阳性细胞主要以中、小型神经元为主。连续鞘内注射生理盐水不会使大鼠DRG p-p38 MAPK阳性反应神经元数量增加(P > 0.05);然而，鞘内连续注射吗啡3 d后DRG p-p38 MAPK阳性细胞数量明显增加(P<0.05)，并且随吗啡注射时间增加而逐渐增多(表1)。第7天时，DRG p-p38 MAPK阳性细胞数量达到最多(58.24 ± 2.85，P < 0.01;图2)，并以小、中型神经元数量增加为主(表2)。在SB + 吗啡组，虽然连续7天鞘内注射SB203580明显抑制了吗啡耐受的形成，但DRG p-p38 MAPK阳性细胞数量与吗啡组相比无差异(53.29 ± 2.43， P = 0.27)，表明SB203580抑制吗啡耐受并非抑制p38磷酸化的结果。

　　3 讨 论

　　本研究发现连续鞘内注射吗啡3 d，DRG神经元p38 MAPK磷酸化水平开始增高，吗啡耐受开始形成;连续鞘内注射吗啡7 d，DRG神经元p38 MAPK磷酸化水平增至最高，而吗啡的镇痛作用已基本消失，吗啡耐受已经形成;而鞘内给予p38 MAPK抑制剂SB203580则可以抑制吗啡耐受的形成，但不能抑制DRG神经元p38 MAPK磷酸化水平的增加。此外，我们还发现在DRG神经元中p-p38 MAPK表达增加以传导温度觉的中、小型神经元为主。

　　目前普遍认为多种信号转导途径、神经递质、神经因子均在神经元及神经胶质细胞参与的吗啡耐受中发挥重要作用。如：?滋阿片受体与G蛋白失偶联、受体内化或下调[6]，NMDA受体数量或功能上调[7]，胞内分子如蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、钙调素Ⅱ(CaMⅡ)表达或功能增强[8];另外，神经递质如兴奋性氨基酸、P物质、钙基因相关肽、一氧化氮和前列腺素等产生增多，从而导致感觉传递神经元敏感化而拮抗吗啡的镇痛作用[9-11]。

　　p38 MAPK作为丝裂霉素蛋白激酶家族的成员，通过对其下游的蛋白或转录因子的调控作用而发挥多种生物学效应。近几年的研究表明，p38 MAPK在多种因素所诱导的疼痛中起着重要作用[3]。Ma等[12]曾在培养的DRG神经元中发现吗啡可以诱导p38磷酸化水平的增加。与这一结果一致，在本研究中我们也发现鞘内慢性注射吗啡可使DRG神经元中的p38 MAPK明显激活，而鞘内给予p38抑制剂SB203580则可以抑制吗啡耐受的形成。这些结果提示p38 MAPK参与了吗啡耐受的产生机制。

　　DRG神经元作为初级痛觉传递神经元，一般认为小型DRG神经元是无髓鞘C纤维的多觉感受器;而中型DRG神经元则是有髓鞘Aδ纤维，与痛觉过敏的产生相关[13]。本研究发现鞘内注射吗啡前， p-p38 MAPK在大鼠DRG的中、小型神经元有少量的基础表达;连续7 d鞘内注射吗啡后，p-p38 MAPK表达明显增加且仍以中、小型神经元中的表达增加为主，大型神经元中的表达无明显变化。这一结果提示p38 MAPK参与吗啡耐受可能与神经元对热痛觉过敏相关。

　　p38 MAPK参与吗啡耐受的机制，我们推测可能是通过其所调节的细胞因子来介导。研究表明，p38 MAPK可以调节TNF-α、IL-1β等炎性因子的产生以及一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX-2)的表达[14-15]，通过增加炎性因子和NO、PGE2的合成提高感觉神经元的敏感性，从而抵消或减弱吗啡的镇痛作用。这些推测有待进一步证实。

　　此外，关于SB203580抑制p38 MAPK作用的机制目前尚存在争议。Sung等[16]发现，SB203580在抑制炎性疼痛的同时也降低了p38 MAPK的磷酸化水平，即抑制了p38 MAPK的激活;但Tong等[17]的研究则认为SB203580通过竞争性的结合p-p38 MAPK上的ATP结合位点抑制酶的活性，并不影响p38 MAPK的激活。我们的研究也证实，SB203580抑制吗啡耐受的形成并非通过抑制p38 MAPK的激活而起作用。

　　综上所述，本研究表明脊髓DRG神经元的p38 MAPK途径参与了吗啡耐受的形成，为揭示吗啡耐受的机制提供了新的证据，并为临床上解决吗啡耐受从而实现长期、更加有效地治疗疼痛提供了新的科学依据。

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