天舒胶囊对偏头痛动物模型血浆一氧化氮、一氧化氮合酶、降钙素基因相关肽含量及血流动力学的影响
发表时间：2009-10-21 浏览次数：796次
天舒胶囊对偏头痛动物模型血浆一氧化氮、一氧化氮合酶、降钙素基因相关肽含量及血流动力学的影响作者：张勤 作者单位：610041成都,四川大学华西医院神经内科 【摘要】 目的 研究天舒胶囊对偏头痛动物模型血浆及脑组织血管活性物质及血流动力学的影响。方法 皮下注射硝酸甘油分别制作大鼠和兔偏头痛模型。给予天舒胶囊后用放免法和分光光度法测大鼠血浆一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)、降钙素基因相关肽(CGRP)含量；通过免疫组织化学染色观察三叉神经脊束核神经元型NOS（NOS1）和CGRP表达；用经颅多普勒检测兔颈内动脉血流速度改变。结果 模型组大鼠血浆NO、NOS和CGRP较对照组明显升高；经不同剂量天舒胶囊灌胃后大鼠血浆NO、NOS和CGRP的增加受到抑制，尤以中、高剂量组明显（P<0.05～0.01）。模型组兔颈内动脉收缩期峰值流速明显下降，经中剂量天舒胶囊干预后流速下降也受到抑制 （P<0.05）。免疫组织化学染色发现灌胃天舒胶囊后，偏头痛大鼠三叉神经脊束核NOS1和CGRP表达增加的程度减小（均P<0.05）。结论 天舒胶囊可改善偏头痛发作时血管活性物质和神经递质水平失常，从而缓解偏头痛症状。 【关键词】 偏头痛,天舒胶囊,一氧化氮,一氧化氮合酶,降钙素基因相关肽 Effects of Tianshu capsule on plasma NO,NOS, CGRP contents and hemodynamics of migraine animal models ZHANG Qin, YANG Tianhua, ZHOU Muke,et al. Department of Neurology, West China Hospital Sichuan University,Chengdu 610041, China Abstract：Objective To investigate the effects of Tianshu capsule on vasoactive substances in blood plasma or brain and hemodynamics in migraine animal models. Methods After subcutaneously administration of nitroglycerin (NTG) and tube feeding Tianshu capsule, the radioimmunoassay or spectrophotometry was used to measure the plasma contents of calcitonin gene related peptide (CGRP), nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) in rats.The distribution of NOS1, CGRP in rat nucleus tratus spinalis nervi trigemini was detected by immunohistostaining, and the changes of internal carotid artery flow velocity in rabbit were measured by transcranial Doppler.Results The levels of NO, NOS and CGRP were elevated in the plasma of migraine rats. Tianshu capsule could inhibit these increases, and the moderateand highdose had much significant effects (P<0.05～0.01). Tianshu capsule could also prevented the decrease of peak systolic velocity of internal carotid artery in rabbit model (P<0.05). It was observed by immunohistostaining that increased expression of NOS1 and CGRP in the spinal trigeminal nucleus of migraine rats were depressed by Tianshu capsule (all P<0.05).Conclusion Tianshu capsule can modulate the unbalance of vasoactive substances and neurotransmitters during the migraine attacks and it may result in relief of the headache. Key words：migraine; Tianshu capsule; nitric oxide; nitric oxide synthetase;calcitonin generelated peptide 天舒胶囊由天麻、川芎精制而成；临床用于治疗偏头痛，有一定的疗效，但其作用机制尚不完全清楚。本实验对偏头痛模型动物给予天舒胶囊，对大鼠血浆一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和降钙素基因相关肽(CGRP)的含量进行测定，同时观察三叉神经脊束核神经元型NOS(NOS1)和CGRP的表达，以及兔颈内动脉收缩期峰值流速的变化，进而探讨该药治疗偏头痛的机制。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物与分组 SD大鼠50只，雌雄各半，质量（200±50）g；随机分为空白对照组，偏头痛模型无干预组，偏头痛模型天舒胶囊高、中、低剂量组(每组10只)，每组中5只作治疗模型，5只作预防模型。新西兰白兔10只，雌雄各半，质量（2.2±0.5）kg，随机分为偏头痛模型无干预组，天舒胶囊治疗中剂量组(每组5只)。均由四川大学实验动物中心提供。 1.1.2 试剂与仪器 天舒胶囊(0.34 g/粒，江苏康缘药业股份有限公司)；硝酸甘油注射液(5 mg/ml，北京益民药业有限公司)；NO和NOS 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CGRP 放免分析试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究中心)；兔抗大鼠 NOS1抗体、兔抗大鼠 CGRP 抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。主要仪器有γ闪烁计数仪，751紫外可见分光光度计，经颅多普勒(TCD)仪(Companion III, Nicolet 公司)。 1.2 方法 1.2.1 偏头痛模型制作 对照组大鼠皮下注射相应剂量95％乙醇，其余各组皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，复制偏头痛模型［1］。根据大鼠的剂量换算，兔皮下注射硝酸甘油5 mg/kg复制模型。 1.2.2 给药方法 大鼠：天舒胶囊用生理盐水配成药液备用，高、中、低剂量组灌胃药量为7.5 g/kg、3.75 g/kg和1.88 g/kg，分别相当于临床用量的10倍、5倍和2.5倍；对照组和无干预组灌胃相应量生理盐水。天舒胶囊治疗模型于注射硝酸甘油/乙醇30 min后按组灌胃给药1次；天舒胶囊预防模型先连续3 d按组给药, 于第3 d给药30 min后造模。白兔：注射后30 min，治疗中剂量组灌胃天舒胶囊1.88 g/kg，无干预组灌胃相应量的生理盐水。 1.2.3 大鼠血浆NO、NOS和CGRP含量测定 大鼠皮下注射硝酸甘油/乙醇4 h后采集标本。经1 %戊巴比妥钠30 mg/ kg 麻醉后开胸，于右心房和上腔静脉交接处采血约5～6 ml。其中3 ml 置入预冷的试管中，每毫升全血加入40000 U/ml抑肽酶10 μl、10%EDTANa2 15 μl，混匀后4℃、3000 r/min离心10 min，分离血浆置-70℃保存，用于测定CGRP。另3 ml全血每毫升加 10%EDTANa2 15 μl，1500 r/min离心10 min，分离血浆-70℃保存，用于测定NO、NOS。血浆CGRP以放免法测定，NOS和NO以可见光分光光度法测定，操作均按试剂盒说明书进行。 1.2.4 大鼠三叉神经脊束核NOS1和CGRP表达检测 取血后对天舒胶囊治疗模型和预防模型中剂量组动物行主动脉插管，剪开右心耳，灌注0.1 mol/L 的 PBS（pH 7.4）至大鼠肝脏变白，右心耳流出液体澄清。继之灌入含 4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS至肝脏变硬，肢体僵直。取出鼠脑放入该固定液中4℃过夜。大鼠脑组织按《大鼠脑立体定位图谱》方法，于前囟后方12.8～13.8 mm之间 (三叉神经脊束核)连续冠状切片，隔5张取1张。免疫组织化学染色用ABC法，兔抗大鼠 NOS1和CGRP 抗体滴度均为1∶100。在 40 倍物镜下盲法观察每张切片相应区域5个不同视野下NOS1和CGRP阳性细胞（胞浆染色呈棕褐色），记录各组阳性细胞数。 1.2.5 兔血流动力学检测 于白兔注射硝酸甘油前5 min和注射后3 h分别行颈内动脉TCD检查。将4 MHz脉冲式探头紧贴兔内眦上方眼睑上，探头略向后及下，探测深度 22～27 mm，探测朝向探头方向的双侧颈内动脉颅内段血流，记录收缩期峰值流速［2］。 1.2.6 统计学方法 实验结果以均数±标准差(±s)表示，模型无干预组与对照组间比较，模型各给药组与无干预组、对照组间两两比较采用t检验。2 结 果 2.1 不同剂量天舒胶囊对大鼠血浆NO、NOS、CGRP含量的影响 见表1。造模后大鼠血浆NO、NOS、CGRP含量较对照组升高(P<0.05～0.01)。在治疗模型和预防模型中，不同剂量的天舒胶囊均能不同程度地抑制上述改变，其中高剂量对血浆NO含量升高的抑制作用较明显(P<0.01)。表1 各组大鼠血浆NO、NOS、CGRP含量的比较注：与空白对照组比较* P<0.05，**P<0.01；与无干预组比较△P<0.05，△△P<0.01 2.2 天舒胶囊对大鼠三叉神经脊束核NOS1和CGRP表达的影响 见表2。经免疫组织化学染色发现大鼠偏头痛模型中三叉神经脊束核NOS1和CGRP阳性细胞数较对照组明显增加(均P<0.05)。天舒胶囊中剂量组和预防组三叉神经脊束核NOS1和CGRP阳性细胞数比无干预组明显减少(均P<0.05)。 2.3 天舒胶囊对白兔偏头痛模型颈内动脉收缩期峰值流速的影响 见表3。经硝酸甘油造模后，白兔颈内动脉峰值流速减慢(P<0.05)，天舒胶囊中剂量治疗组较无干预组流速减慢受抑制（P<0.05）。 表2 各组大鼠三叉神经脊束核NOS1和CGRP阳性细胞数比较 表3 白兔偏头痛模型组颈内动脉收缩期注：与造模前比较* P<0.05；与无干预组比较△P<0.053 讨 论 目前在偏头痛的发病机制中三叉神经血管学说占主导地位。当三叉神经血管系统或中枢神经内源性疼痛调节系统功能缺陷时，分布于血管壁、硬膜的三叉神经无髓纤维受到刺激, 释放CGRP、P 物质等血管活性物质，产生神经源性炎症，使血管扩张、血浆成分外渗、肥大细胞脱颗粒和血小板激活［3］ 。感觉传入纤维进一步兴奋，可加重神经源性炎症，并兴奋脑干、下丘脑和大脑皮质等高级中枢引发头痛。 硝酸甘油动物模型能较好地模拟上述过程［4］。其代谢产物NO兼有内源性血管扩张剂和神经递质的双重功能；可增加硬膜细胞因子和诱导型NOS(Ⅱ型)的表达，介导神经源性炎症。有研究［5］发现偏头痛患者发作期血中NO的含量明显高于间歇期和对照组，间歇期NO的含量下降，但仍高于对照组 。此外，NO参与了伤害性刺激的产生、传递和神经元致敏，而钙依赖性内皮细胞型(Ⅲ型)和神经元型(Ⅰ型)NOS的激活与痛觉过敏状态的形成和维持有关［6］。NOS的抑制剂可明显减轻偏头痛发作［ 7 ］。 CGRP是一种强烈的舒血管肽。脑血管壁的CGRP能神经纤维主要起源于三叉神经节与脊髓背根节，三叉神经核（接受感觉初级传入末梢）亦有大量CGRP类免疫活性物质；CGRP释放后将引起扩血管反应，神经源性炎症等，并在痛觉传递和调控过程中发挥作用［8］。研究［9, 10］发现偏头痛发作期CGRP升高的同时伴脑血流量增加。5HT受体激动剂舒马曲坦和CGRP拮抗剂BIBN4096BS通过降低患者血浆CGRP水平或阻断其作用，使头痛缓解；NO可激活NOS1，促进CGRP释放而加重偏头痛［11］。 在本实验中偏头痛大鼠模型组血浆NO、NOS和CGRP含量较对照组增加(P<0.05)，兔颈内动脉峰值流速因血管扩张而明显下降(P<0.05)，提示体内NO和CGRP水平失衡，血管舒缩功能异常，导致头痛发作，与既往研究［12］一致。三叉神经脊束核尾侧亚核(trigeminal nucleus caudalis)同伤害性感觉及功能整合有关，经硝酸甘油作用后该区域NOS1和CGRP表达明显增强，提示其参与了中枢神经系统致敏和痛觉信息传递 ［13］。 天舒胶囊中的天麻可收缩脑血管、降低供血量；而川芎有效成分之一川芎嗪可降低血管阻力，提高血流量，促进血管侧枝循环的建立和微循环的自动调节。在本研究中，白兔偏头痛模型经天舒胶囊灌胃后，颈内动脉血流速度降低的幅度明显减小，提示天舒胶囊中天麻和川芎配伍可协同调节颅内血管舒缩功能。本研究中以治疗或预防方式给大鼠模型以不同剂量的天舒胶囊灌胃，与对照组比较，均在一定程度上抑制了血浆NO、NOS、CGRP含量的升高（P<0.05～0.01），其抑制三叉神经脊束核NOS1和CGRP的激活，从而对抗血管活性物质和神经递质水平的失常，调节脑及血管功能紊乱。既往研究［14］发现川芎天麻配伍对血管内皮细胞和神经元的钙通道有阻滞作用。天舒胶囊可能通过阻滞钙通道，抑制钙依赖性NOS的活性，或者阻断继发于NO、CGRP活化后的钙离子内流，进而干扰下游一系列病理改变，发挥治疗偏头痛的作用。【参考文献】［1］Tassorelli C, Joseph SA. 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