银杏叶提取物对缺血再灌注大鼠脑梗死体积及半胱氨酸蛋白酶表达的影响

作者：赵冬雪，张鸿    作者单位：110004沈阳，中国医科大学附属盛京医院神经内科

【摘要】  目的 研究银杏叶提取物（EGb）对缺血再灌注大鼠脑梗死体积及半胱氨酸蛋白酶（caspase）3表达的影响。方法 用线栓法制作脑缺血再灌注大鼠模型。小剂量EGb组及大剂量EGb组大鼠于实验前30 min和缺血后1 h分别予以EGb 50 mg/kg、100 mg/kg腹腔注射。用氯化三苯四氮唑染色和免疫组化染色法观察大鼠脑梗死体积与脑组织caspase3阳性细胞数；并与缺血再灌注组比较。 结果 小剂量EGb组和大剂量EGb组大鼠脑梗死体积［（83.4±2.9）mm3，（37.0±2.5）mm3］明显小于缺血再灌注组［（138.8±6.1）mm3］（均P<0.01）；脑组织caspase3阳性细胞数［（12.15±1.42）、（7.41±1.55）个/高倍视野］明显少于缺血再灌注组［（26.85±1.63）个/高倍］（均P<0.01）；大剂量EGb组脑梗死体积及脑组织caspase3阳性细胞数比小剂量EGb组明显减少（均P<0.01）。 结论 EGb可以减小缺血再灌注大鼠的脑梗死体积以及抑制caspase3蛋白的表达；并且大剂量EGb的效果比小剂量EGb的更好。

【关键词】  缺血再灌注；半胱氨酸蛋白酶3；银杏叶提取物

    Effects of Ginkgo biloba extract on volume of cerebral infarction and expression of caspase3 in ischemicreperfusion rats  ZHAO Dongxue,ZHANG Hong. Department of Neurology,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang 110004,China

    Abstract：Objective  To study the effects of Ginkgo biloba extract(EGb) on the volume of cerebral infarction and  expression of caspase3 in ischemicreperfusion rats. Methods  Setting up the brain ischemic and reperfusion model in rats by Nagasawa way. Both groups rats treated with small dose of EGb and large dose of EGb were injected intraperitoneally with EGb 50 mg/kg and 100 mg/kg at 30 min before the trial and 1 h after cerebral ischemic respectively. The infarction volume and caspase3  expression were detected by TTC staining and immunohistochemistry.Then the results were compared with ischemicreperfusion group. Results  In groups treated with small dose of EGb and large dose of EGb, infarction volumes ［（83.4±2.9）mm3，（37.0±2.5）mm3］ were smaller obviously than that in the ischemicreperfusion group ［（138.8±6.1）mm3］（all P<0.01）, caspase3 positive cells decreased obviously too［（12.15±1.42）/HP，（7.41±1.55）/HP vs （26.85±1.63）/HP］（all P<0.01）. The group treated with large dose of EGb compared with the group treated with small dose of EGb, infaction volume was decreased, and the number of caspase3 positive cells was reduced obviously（all P<0.01）. Conclusions  EGb can reduce the infarction volume and suppress the expression of caspase3 in ischemicreperfusion rats.The effects of large dose EGb is better than that of small dose EGb.

    Key words：ischemicreperfusion; caspase3; Ginkgo biloba extract

        脑缺血后神经细胞以凋亡、坏死两种方式死亡［1］。研究［2］显示神经元凋亡受一系列基因的调控［2］，其中半胱氨酸蛋白酶（caspases）基因家族与凋亡的发生有着密切的关系。caspases家族是一组天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，特异性在天门冬氨酸残基后裂解靶蛋白，受到一定的信号刺激后通过蛋白酶级联反应顺序激活，在实施凋亡过程中起关键作用。其中caspase3是级联“瀑布”下游反应中最关键的效应酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。银杏叶提取物（EGb）目前在临床上被广泛应用于治疗缺血性脑血管病，其具有抗氧化、清除自由基、抑制兴奋性氨基酸的释放、抗炎及抑制神经细胞凋亡等多种生物效应。本实验观察EGb 对缺血再灌注大鼠脑梗死体积及caspase3表达的影响，以探讨EGb对缺血再灌注脑损伤的保护机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  健康雄性Wistar大鼠40只，质量250～300 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。随机分为4组：假手术组、缺血再灌注组、小剂量EGb组以及大剂量EGb组，每组10只。以上各组再随机均分为两组，一组用于脑梗死体积测定（5只），另一组用于caspase3蛋白测定（5只）。

    1.1.2  药物与试剂  EGb注射液（金纳多注射液，德国威玛制药厂生产）；caspase3免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术开发公司）

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型制作与处理  采用改良Nagasawa法［3］建立大鼠脑缺血再灌注模型。大鼠以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上。颈部正中切口，钝性分离至颈前肌，于左侧颈前肌旁分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉(ICA)，并分别结扎其根部。在CCA近分叉处剪一小口，插入直径0.23 mm的尼龙线（18 mm处作标记），插入约（18±0.5）mm固定插线，缝合皮肤。1 h后，拔出插线实现再灌注。假手术组除不结扎动脉、不插线外，其余步骤相同。术中用白炽灯加温，维持大鼠肛温约37℃。EGb小剂量组、大剂量组大鼠在实验前30 min和缺血后1 h分别给予金纳多注射液50 mg/kg、100 mg/kg腹腔注射，另外两组大鼠腹腔注射生理盐水50 ml/kg。

    1.2.2  取材与制片  于脑缺血再灌注6 h时,各组取5只大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏。剪开右侧心耳和左侧心尖，用静脉留置套管针自左侧心尖处切口穿刺，经过左侧心室至主动脉开口处，拔出针芯，先用肝素盐水150 ml（生理盐水500 ml+肝素2500 U）快速灌注，至肝脏颜色明显减退至浅红或黄白，右心耳流出无色透明液体，再用4%多聚甲醛PBS缓冲液150 ml固定。然后断头、取全脑，置于4%多聚甲醛PBS缓冲液固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋。连续冠状位切片，厚度6  μm，行HE染色，取相邻切片用于caspase3免疫组化染色。

    1.2.3  脑梗死体积测定  在缺血再灌注6 h时，各组取5只大鼠10%水合氯醛深度麻醉，快速断头取脑。将鼠脑立即置于-20℃冰箱中10 min后取出，行2 mm厚连续冠状切片，共5片。将切片立即置于2%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液中，37℃恒温下避光染色30 min，然后置于4℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24 h。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色，数码相机拍照，用LuxexF图像分析仪测定每张脑片的梗死面积，根据公式V=t（A1+A2+……An）-（A1+An）t/2计算梗死体积，其中t为切片厚度，A为梗死面积。

    1.2.4  Caspase3免疫组化染色  采用SP法，按照caspase3免疫组化染色试剂盒说明书的操作步骤进行操作。阴性对照，一抗用PBS代替。在高倍镜（400倍）下随机观察缺血周围区8个不重叠的视野，细胞核中有棕黄色颗粒的为阳性细胞，计数每个视野的阳性细胞，计算平均阳性细胞数。

    1.2.5  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示，用SPSS 11.0统计软件分析处理。多组间均数比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA），两两比较采用Dunnett t检验及SNK法，相关分析采用Pearson法。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠脑组织HE染色结果  假手术组大鼠脑组织细胞层次分明，神经细胞形态、结构正常。缺血再灌注组大鼠缺血侧额、顶叶皮质、皮质下白质及基底节区神经元坏死、缺失，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，胞浆淡染，胞核固缩、溶解，结构不清。EGb小剂量组、大剂量组大鼠缺血侧脑组织神经细胞缺失较缺血再灌注组轻，正常细胞与坏死细胞相间存在；其中EGb大剂量组神经元坏死、缺失程度又轻于EGb小剂量组。

    2.2  各组脑梗死体积比较  见表1。假手术组大鼠脑组织未发现梗死灶；缺血再灌注组大鼠脑梗死灶主要位于额顶叶皮质、尾状核、内囊后肢；小剂量 EGb组大鼠脑梗死体积明显小于缺血再灌注组，大剂量 EGb组脑梗死体积又明显小于小剂量 EGb组，各组间差异有统计学意义（均P<0.01）。见图1。

    2.3  各组脑组织caspase3阳性细胞数比较  见表1。假手术组大鼠脑组织可见到少量caspase3阳性细胞。3个缺血再灌注模型组大鼠caspase3阳性细胞主要位于梗死灶周围区域，阳性细胞数明显多于假手术组（均P<0.01）。小剂量及大剂量 EGb组大鼠脑组织caspase3阳性细胞数明显少于缺血再灌注组，其中大剂量 EGb组又明显少于小剂量 EGb组（均P<0.01）。见图2。 表1  各组大鼠缺血脑梗死体积及caspase3阳性细胞 数的比较注：各组间比较均Ｐ<0.01

    2.4  Caspase3阳性细胞数与脑梗死体积的相关性大鼠脑组织caspase3阳性细胞数与脑梗死体积呈正相关（r=0.949，Ｐ<0.001）。

    2.5  EGb剂量与caspase3阳性细胞数及梗死体积的相关性  EGb剂量与大鼠脑组织caspase3阳性细胞数及脑梗死体积呈负相关（r=-0.856，r=-0.924，均Ｐ<0.01）。

  3  讨  论

    Linnik等于1993年首先提出缺血性神经元死亡与细胞凋亡有关，脑缺血后局部神经元过度凋亡是造成再灌注损伤的主要原因之一，且在梗死形成过程中发挥重要作用，也是神经元迟发性死亡的主要形式［4］。凋亡是细胞在各种死亡信号刺激下发生的系列、瀑布式激活的主动性细胞死亡过程。一些研究提示重度长时间缺血引起神经细胞坏死，轻度短时间缺血及再灌注易引起神经细胞发生凋亡［5］。关于凋亡的确切发生机制目前尚不是很明确，有研究［6］显示，神经元凋亡受一系列基因的调控，caspases基因家族在缺血性损伤中发挥着重要作用，是哺乳动物细胞凋亡的启动和执行者。细胞凋亡的caspases通路主要分为细胞膜受体通路、线粒体通路和内质网通路［7］，caspase3是上述3条通路级联激活的必经之路，处于核心地位，也被称为死亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。在神经系统中，caspase3不仅可以促进脑发育时期的神经元凋亡，还可以促进各种因素诱导的培养神经元的凋亡，这提示caspase3可能是缺血神经元凋亡的重要效应分子［8］。有研究［9］发现，大鼠局灶性缺血及再灌注后早期caspase3 mRNA表达不明显，在缺血再灌注后4～48 h表达逐渐增高。提示caspase3参与了迟发性神经元的死亡过程。

    本实验发现假手术组大鼠脑内有个别caspase3阳性细胞，表明在正常或非应激状态下脑内就有少量caspase3基因的表达，以随时监视基因组的完整性并及时清除偶发DNA损伤的神经细胞，保持神经系统稳定性，防止突变的发生。在脑缺血再灌注大鼠脑组织中caspase3蛋白表达增强，与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.01），caspase3蛋白的表达水平与脑梗死体积之间呈正相关（r=0.949，P<0.001）；提示缺血性脑损伤可诱导caspase3蛋白的表达。

    神经细胞凋亡是一迟发性病变，在一定条件下具有可逆性，因此寻求有效药物抑制脑缺血后神经元过度凋亡是实现脑保护的一条重要途径。EGb的主要有效成分为24%黄酮类和6%萜内酯。EGb具有广泛的生物学效应，如清除自由基、血小板活化因子（PAF）受体拮抗作用，抑制PAF引起的血小板凝聚、血管内皮损伤、微血栓形成及改善脂代谢紊乱、抗脑水肿、增加脑血流量和改善脑代谢等。已有研究［10］证明，凋亡细胞主要分布在梗死灶边缘区（半暗带区），细胞凋亡参与缺血后梗死的扩大。因此，抢救半暗带区的神经细胞，减少细胞发生凋亡能减轻脑缺血再灌注损伤的程度和范围［11］。本实验大鼠局灶性脑缺血再灌注后，缺血侧脑组织出现大量的caspase3阳性细胞，主要位于额、顶叶皮质及纹状体区。有研究［12，13］表明，EGb对缺血引起的神经细胞凋亡有拮抗作用，能改善神经细胞的亚微结构的变化，减少凋亡细胞数，使缺氧复氧诱导的神经细胞调亡百分率明显下降，从而保护缺血性神经元的损伤。其机制可能与EGb能清除自由基、抑制蛋白激酶C（PKC）的活性及改变Bcl2、Bax基因的表达有关。但是关于EGb对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡相关基因caspase3表达影响的研究鲜见报道。本实验结果显示大剂量、小剂量EGb组大鼠脑梗死体积明显小于缺血再灌注组，缺血坏死程度也减轻，caspase3阳性细胞数明显减少，3组间比较差异有统计学意义（均P<0.01）。此结果表明EGb可以通过抑制脑缺血后caspase3的活性来减少凋亡的发生，具有良好的脑保护作用。另外，本实验结果还显示，大剂量EGb组的脑梗死体积较小剂量EGb组减小，caspase3阳性细胞数减少，两组之间的差异有统计学意义（均P<0.01）。同时本实验还发现EGb剂量与caspase3阳性细胞数及脑梗死体积之间呈负相关（r=-0.856，P<0.001；r=-0.924，P<0.001），表明大剂量EGb的疗效较好。

    本实验虽然发现EGb可以抑制caspase3表达，减少神经细胞凋亡，保护缺血的脑组织，但其具体机制有待于进一步研究。

【参考文献】［1］Yamada A,Isono M,Hori S,et al.Tamperal and spatial profile of apoptotic cells after focal cerebral ischemia in rats［J］.Neural Medonin,1999,39:575.

［2］Wyllie AH.Apoptosis:an overview［J］.British Medical Bulleti,1997,53:451.

［3］Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke,1989,20:1037.

［4］Dell Anna E,Chen Y,Engidawork E, et al.Delayed neuronal death following perinatal asphyxia in rat［J］.Eep Brain Res,1997,115:105.

［5］Li Y, Sharov VG,Jiang N, et al. Ultrastruoural and light microscopic evidence of apoptosis in rat［J］.Am J Pathol,1995,146:1045.

［6］Earnsshaw WC,Martins LM,Kaufmann SH.Mammalian caspase:structure,activation,subtrates,and functions during apoptosis［J］.Annu Rev Biochem,1999,68:383.

［7］Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al.Caspase12 mediates endoplasmicreticulumspecific poptosis and cytotoxicity by amyloidbeta［J］.Nature,2000,403:98.

［8］Yuan J,Yankner BA.Apoptosis in the nervous system［J］.Nature,2000,407:802.

［9］王宇卉，邵福源，夏春林，等.大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型中caspase3的表达［J］.临床神经病学杂志，2003，16：214.

［10］Kogure T,Kogure K. Molecular and biochemical events within the brain subjected to cerebral ischemia［J］.Clin Neurosci,1997,4:179.

［11］Li Y,Chopp M,Jiang N,et al. In situ detection of DNA fragmentation after focal cerebral ischemia in mice［J］.Brain Res Mol Brain Res ,1995,28:164.

［12］王小姗，狄晴， 曹辉，等. 银杏叶提取物对缺血再灌注鼠脑保护作用的研究［J］.临床神经病学杂志,2006,19:53.

［13］李浩, 刘开祥, 俸军林,等.银杏叶提取物对脑缺血再灌注大鼠P选择素表达及髓过氧化物酶活性的影响［J］.临床神经病学杂志,2007,20:435.