脊髓薄片制备方法的改进及其脊髓Ⅱ板层神经元突触后电流的记录
发表时间:2011-03-11 浏览次数:455次
作者:王秀丽 张奇 郭跃先 陆萍 作者单位:050051 石家庄市,河北医科大学第三医院麻醉科
【摘要】 目的 探讨记录脊髓Ⅱ板层神经元兴奋性和抑制性突触后电流的方法。方法 SD雄性大鼠,160~180 g,2%氟烷和100%氧气吸入麻醉后快速取腰段脊髓,迅速放入冰冷充氧的人工脑脊液,将约1 cm长的脊髓粘立于振动切片机载物台上,同时覆以冰冷的人工脑脊液进行横切片,片厚350~450 μm, Kreb’S液提前30 min用95%CO2和5%O2预充氧,将切好的脊髓薄片转移其中,34~35℃孵育至少1 h后,以备实验记录用。结果 在倒置显微镜下可清楚分辨出脊髓Ⅱ板层神经元。采用全细胞电压钳记录技术,给予选择性受体阻断剂以分离不同的突触后受体电流。在钳制电压为-70 mV 时,可以记录到谷氨酸能的兴奋性突触后电流(EPSCs);而在钳制电压为0 mV时,可以记录到抑制性突触后电流(IPSCs)。结论 该方法为研究脊髓Ⅱ板层神经元递质释放提供了有效的途径。
【关键词】 全细胞电压钳;脊髓;Ⅱ板层;兴奋性突触后电流;抑制性突触后电流
The improvement of spinal cord slice preparations and records of postsynaptic currents in lamina Ⅱ neurons of spinal cord WANG Xiuli, ZHANG Qi, GUO Yuexian, et al. The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051
【Abstract】 Objective To investigate the method that records the excitatory postsynaptic currents (EPSCs) and inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) in lamina Ⅱ neurons of spianl cord.Methods Male SD rats weighted 160~180 g were used. The rats were anesthetized with 2% halothane and 100% O2, the lumbar segment of the spinal cord was rapidly removed through a limited laminectomy. The segment of the lumbar spinal cord was immediately placed in icecold sucrose artificial cerebrospinal fluid (aCSF) presaturated with 95% O2 and 5% CO2. The 1 cm block was then placed in a shallow groove formed in a gelatin block and glued on the stage of a vibratome. Transverse spinal cord slices (350~450 μm) were cut in the icecold sucrose aCSF and then preincubated in Kreb’s solution continuously gassed with 95% O2 and 5% CO2 at 34~35℃ for at least 1 hour before they were transferred to the recording chamber.Results The lamina Ⅱ had a distinct translucent appearance and could easily be distinguished under the microscope. The recordings of postsynaptic currents were performed by using the wholecell voltageclamp method. Specific receptor antagonist was used to separate the different postsynaptic currents. The currents of excitatory postsynaptic currents (EPSCs) were recorded at the holding potential of -70 mV, while the currents of inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) were recorded at the holding potential of 0 mV.Conclusion The methods provide the effective approach for studying the neurotransmitter release in spinal lamina Ⅱ neurons.
【Key words】 wholecell voltageclamp; spinal cord; lamina Ⅱ; EPSCs; IPSCs
Ⅱ板层作为痛觉信息传入的初级整合部位,集中了大量小细胞和无髓鞘轴突末梢,其内的神经元具有胞体直径小(10~20 μm),且分布密集的特点。在脊髓背角中与其它层形成明显区别,即胶状质区(substantia gelatinosa, SG)。Ⅱ板层内含有大量的兴奋性(谷氨酸能)和抑制性(GABA、甘氨酸及内啡肽能等)神经元,这些神经元上同时表达丰富的β受体、GABA受体、甘氨酸受体和M胆碱能受体,这些受体均参与疼痛的调节作用,调控着体内伤害性感受器的活性反应[1-3]。因此,目前认为Ⅱ板层是接受和调控伤害性信息由外周向中枢传递的关键部位[4]。由于Ⅱ板层神经元的特殊地位,使之成为研究伤害性信息突触传递的重要目标。鉴于方法学的限制,Ⅱ板层神经元突触传递的电生理学研究是个难点。主要原因是成年大鼠的Ⅱ板层神经元对缺血缺氧很敏感,离体标本的背根纤维容易损伤,因而制作脊髓薄片标本比较困难,脊髓细胞存活时间较短,影响实验结果的准确性。本实验在以往传统方法基础上加以改进,为脊髓薄片的制备及Ⅱ板层神经元细胞兴奋/抑制性突触后电流的记录提供有效的方法。
1 材料与方法
1.1 动物 一级健康纯种SD大鼠(Harlan,Indianapolis, IN),3~4周龄,体重160~180 g,动物饲养环境安静,通风和空气过滤消毒系统良好,室温控制在20℃左右,湿度为55%左右。每日更换笼具和垫料。
1.2 主要液体的配制
1.2.1 蔗糖高渗人工脑脊液:234 mmol sucrose,3.6 mmol KCl,1.2 mmol MgCl2,2.5 mmol CaCl2,1.2 mmol NaH2PO4,12.0 mmol glucose,25.0 mmol NaHCO3。
1.2.2 Kreb’s灌流液: 117.0 mmol NaCl, 3.6 mmol KCl,1.2 mmol MgCl2,2.5 mmol CaCl2,1.2 mmol NaH2PO4,11.0 mmol glucose,25.0 mmol NaHCO3。
1.2.3 记录抑制性突触后电流电极内液:110 mmol Cs2SO4,5 mmol KCl, 2.0 mmol MgCl2,0.5 mmol CaCl2,5.0 mmol HEPES,5.0 mmol EGTA,5.0mmol ATPMg, 0.5mmol NaGTP,1 mmol guanosine 5'O(2thiodiphosphate) (GDPβS), 10 mmol QX314,用1 mol CsOH调节pH值到 7.2~7.4,渗透压为290~320 mOsm。
1.2.4 记录兴奋性突触后电流电极内液:135 mmol Kgluconate,5 mmol KCl,0.5 mmol CaCl2,2 mmmol MgCl2,5 mmol EGTA,5 mmol HEPES,5 mmol MgATP,用1 mol CsOH调节pH值到 7.2~7.4,渗透压为290~320 mOsm。
1.2.5 PBS缓冲液:NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,去离子蒸流水定容至1 000 ml,调整pH值至7.4,4℃保存备用。
1.2.6 琼脂胶:琼脂3 g加入150 ml水中加热至100℃煮沸5 min,待冷却后切成小方块,在4℃冰箱储存备用。
1.3 所用主要仪器设备 电生理记录(pCLAMP 9.0,Axon Instruments,USA)、信号放大器(Multiclamp 700A, Axoo Instruments,USA)、计算机记录系统(Dell,USA)、记录电极微控器(MP285 Sutter Instrument CO,USA)、刺激电极微控器(MC 1000e Controller,USA)等。
1.4 标本制作的改进 参照Yoshimura等[5]的方法,在脊髓薄片的制备过程中加以改进,延长了实验细胞的存活时间。(1)大鼠吸入2%甲烷和100%O2 2~5 min后麻醉,避免应用氯胺酮等全麻药物,以减少对脊髓Ⅱ神经元细胞膜受体的影响。(2)沿背正中线由骶髓水平向上到胸髓水平剪开背部皮肤,用小组织剪沿椎骨棘突两侧剪开肌肉,暴露横突,切除椎板,暴露脊髓,避免损伤脊髓表面的血管,约需6~10 min;(3)用34~35℃的人工脑脊液孵育暴露的脊髓,必须保证脊髓从手术损伤中恢复15 min,脊髓表面无苍白缺血。大鼠持续吸氧,保温;同时准备用冰充填切片槽内的空间,以保证槽内温度为0℃;以降低细胞的氧耗。(4)1 min内快速取出脊髓。从下端腰骶段向上至胸髓水平,横断脊髓,连同蛛网膜和软膜一并取出,迅速置于冷的预冲氧的高渗灌流液(Krebs液)中;保证温度在0℃。(5)在高倍显微镜下2 min内尽快除去蛛网膜和软膜,避免损伤脊髓背角组织。(6)用速粘胶将约1 cm长的脊髓粘立于振动切片机载物台上,覆以冷Krebs液,2 min内用振动切片机切片,片厚为350~450 μm;保证槽内温度为0℃。(7)脊髓薄片标本在含95%O2和5%CO2的人工脑脊液中孵育至少1 h。将标本转移到记录槽中,Krebs液持续灌流,以备记录用。
2 结果
2.1 脊髓薄片组织细胞的状态 为了制成好的切片,应供给充足的氧气,为降低氧需和氧耗必须使组织保持在低温状态。为了避免切片机的刀片对组织的压迫,在7%~10%Hz频率状态下推进水平震动的切片到切制300~450 μm的薄片。对刀片行进的速度应在低倍显微镜下进行监视,在最重要的部位如行进至Ⅱ板层的部位,应缓慢行进,使压迫减少至最小,对其他部位则可快速推进尽量缩短制片时间,将薄片尽快转移到人工脑脊液中孵育,理想的组织薄片应该是在最表面有高密度的凸出的健康细胞存在。遵循该方法制备的脊髓切片,共记录正常3~4周SD大鼠脊髓Ⅱ板层细胞113个,记录时间最长达368 min,最短为120 min。
2.2 Ⅱ板层神经元(SG神经元)的鉴别 标本置于灌流槽内,通过下部的投射光源,倒置显微镜下可见Ⅱ板层呈半透明状,可很容易地与相邻层次(Ⅰ和Ⅱ板层)区分(图1)。Ⅰ层是覆盖在脊髓背角表面最薄的一层细胞,通常是一个细胞的厚度。Ⅱ板层集中了大量小细胞和无髓鞘轴突末梢,在脊髓背角中与其它层形成明显区别,为此,人们将其命名为SG[1]。Ⅱ板层区分为内外两区,其中位于外侧的神经元形态多为柄细胞多数是兴奋性神经元,而内侧的神经元形态多为岛细胞,多数是抑制性中间神经元 (图1)。Ⅲ板层是由大量的有髓鞘纤维、投射神经元和类似Ⅱ板层中的中间神经元组成[1-3]。该层神经元细胞较大,形态多样,分布疏松,其轴突和树突分支更为广泛(图2)。其轴突除投射到Ⅱ板层区、背角深层和邻近白质外,还投射到延脑尾端的薄核、楔核和外测颈核。
2.3 突触后电流的记录 形成全细胞膜片钳记录的封接方法是在用微电极控制仪操纵记录电极尖端接近、但不接触标本Ⅱ板层神经元的表面,封接阻抗为3~5 MΩ[6]。通过20 ml的玻璃注射器从后部给电极内加正压,以防止电极尖端在脊髓组织内被堵塞。然后用倒置显微镜转换图像至监视器上,可见正压充气的记录电极(图3)。用微电极操作仪继续推进电极,直到电极内的气流吹开Ⅱ板层神经元周围组织,找到形态规则饱满的神经元,将电极调整好适当的位置,轻轻的接触到细胞附近,逐渐减少电极内压,使电极与细胞轻轻吸附在一起,当电极尖端接近一个神经元胞体时,由于封接阻抗明显增大至GΩ。此时将钳制电压设定为-70 mV,注射器正压释放并转为负压吸引即可形成封接。等待约30 s,待封接完全形成,再适当加大负压,直至细胞膜被吸破。此时可在监视器上见到神经元特有的兴奋性突触后电流特征波形。在钳制电压持续为-70 mV时,一般可以观察到微小自发性兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)(图4);在钳制电压为0 mV时,可以记录到微小自发性抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs)(图5)。因为IPSCs的反转电压在-70 mV附近,故-70 mV时记录到的EPSCs不含有IPSCs的成分。与此类似,因为EPSCs的反转电压在 0 mV附近,所以0 mV记录到的IPSCs不含有EPSCs的成分[7]。将刺激电极放置在脊髓背根区域,即可记录到刺激引起的eEPSCs(evoked EPSCs)和eIPSCs(evoked IPSCs)[6](图6)。根据电刺激的频率和诱发的突触后电流的波形变化,可判断该反应是通过多突触还是单突触神经元的传导。
图1 Ⅱ层神经元Ⅱ板层区分为内外两区,其中位于胶质区外侧的神经元形态多为柄细胞(stalked)多数是兴奋性神经元,而内侧的神经元形态多为岛细胞(islet),多数是抑制性中间神经元〖〗图2 Ⅲ板层是由大量的有髓鞘纤维、投射神经元和类似Ⅱ板层中的中间神经元组成。该层神经元细胞较大,形态多样,分布疏松图3 通过一个玻璃注射器(总容量20 ml)从后部给电极内加正压,以防止电极尖端在脊髓组织内被堵塞。可见正压充气的记录电极
图4 钳制电压为-70 mV时,可以记录到微小自发性兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)图5 钳制电压为0 mV时,可以记录到微小自发性抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs)图6 A将刺激电极放置在脊髓背根区域,钳制电压为-70mV时,即可记录到刺激引起的eEPSCs(evoked EPSCs);B钳制电压变为0 mV时,即可记录到刺激引起的eIPSCs(evoked IPSCs)。
3 讨论
本课题通过活体脊髓薄片的制备步骤的改进,结合特异性受体阻断剂,探讨成年大鼠脊髓薄片制备的最佳途径,以及应用全细胞膜片钳技术记录脊髓II板层神经元突触后电流的有效方法。膜片钳技术是用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜,以千兆欧姆以上的阻抗使之封接,使与电极尖端开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上分隔,在此基础上固定电位,对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行检测记录的方法。应用全细胞电压钳技术,在成年大鼠脊髓薄片记录脊髓神经元突触后电流,同时在电极内液中加入G蛋白的阻断剂GPDβs以消除与G蛋白耦联的突触后膜受体的影响,另外也加入钙离子鳌合剂和钾离子通道受体阻断剂乙二醇双四乙酸EGTA和CaSO4等[5,6],当灌流液中持续给予A型r氨基丁酸(GABAa)受体阻断剂荷包牡丹碱(bicucullin)和甘氨酸受体阻断剂士可宁(strychnine),钳制电压为-70 mV 时,可以记录到谷氨酸能的自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)以及刺激背根纤维引起的eEPSCs。而当灌流液中持续给予非N甲基D天冬氨酸受体阻断剂CNQX和士可宁,钳制电压变为0mV时,可以记录到GABA能自发的抑制性突触后电流(sIPSCs)或者刺激背根引起的eIPSCs;当把甘氨酸受体阻断剂士可宁改为GABAa受体阻断剂荷包牡丹碱时,则可记录到甘氨酸受体介导的甘氨酸能突触后电流[7,2]。还可以用刺激电极刺激脊髓背根入口区域或刺激电极直接接触到脊髓背根,研究局部刺激引起递质释放的变化情况。此方法可满足刺激初级传入纤维引起的突触活动变化情况的研究以及脊髓背角神经元局部突触传递的研究需要。
在记录过程中常遇到以下的问题,通过脊髓薄片制备及其它设备的改进可及时解决。(1)无法形成封接:本文介绍的方法是在可视显微镜下直观地看到记录神经元,可以清楚的判断电极和神经元的相对关系,故属于可视膜片钳法。该方法的特点是容易形成封接,但设备昂贵,对脊髓切片的技术要求较高。脊髓薄片厚度一般为350~450 μm。如果过厚,电极压力不足以吹开Ⅱ板层的神经组织,不易发现存活状态佳的细胞,从而不易形成细胞封接;另外记录电极尖端过粗或过细,封接阻抗过小或过大,均不易形成有效的细胞封接[8,9],往往使实验记录半途而废。此时最好更换电极,调整好封接阻抗在3~5 MΩ,再次尝试。一般通过多次练习,即比较容易形成记录封接。(2)记录细胞存在衰减现象:全细胞记录法的问题之一就是细胞机能活动低下,实验过程中存在的衰减。这是因为用电极内液置换了细胞内液,从而使维持细胞功能所必须的可溶性成分丢失或漏失所致。所以我们在电极内液中适量补充已知可能丢失的成分以防止衰减的速度。如在电极内液中补充ATP,以减慢钙离子电流的衰减速度。在受体信息传递过程中有与G蛋白相关系统的存在,为了维持这种受体的机能,也可在电极内液中加入0.1~0.3 mmol的GTP。另外,由于脊髓神经元对耐受缺血和缺氧能力较差,外部环境下细胞存活能力低,所以在记录过程中往往出现衰减,此时应检查孵育水箱的温度控制在34~35℃,灌流液的速度应在3 ml/min以上,一般为5 ml/min,保证细胞在记录过程中充足的氧供。同时根据灌流速度调整注药泵的速度,确保药物浓度的准确性。另外灌流液的渗透压应为290~320 mOsm,保证细胞膜的活性张力[10]。(3)无法记录到刺激引起的突触后电流:在脊髓薄片的制作过程中极易损伤背根,由于背根进入脊髓后有的纤维还要上升或下降一定的节段才终止于背角神经元。而制备的脊髓薄片一般是350~450 μm,因此进入脊髓的部分上下行纤维可能被切断,导致实验中经常记录不到刺激背根引起的突触后电流。另一方面,当无法记录到刺激背根的反应时,可以在脊髓背根入口区域微调刺激电极,在监视器中观测到由于刺激电极的进退而引起的脊髓薄片的移动,再给予刺激观察刺激引起的突触后电流。如仍无记录,要考虑及时更换标本或电极,寻找其他可能保留初级传入的神经元[7]。
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