依达拉奉对脑出血大鼠脑组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力及脑水含量的影响

作者：周红杰，朱洁，王景周，蒋晓江    作者单位：400042重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科

【摘要】  目的 研究依达拉奉对实验性脑出血大鼠氧自由基反应及脑水含量的影响。方法 采用立体定向自体血注入法制作实验性脑出血大鼠模型，依达拉奉组在制作模型前后给予依达拉奉腹腔注射；脑出血组大鼠不予干预；脑组织氧自由基丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法,超氧化物歧化酶（SOD）活力测定采用黄嘌呤氧化法，脑水含量测定采用干湿重法。并与假手术大鼠（对照组）比较。结果 脑出血组MDA含量较对照组显著增加（P<0.01）、SOD活力显著降低（P<0.01）、脑水含量增加（P<0.05～0.01）。依达拉奉治疗组与脑出血组比较，在脑出血后1 d、3 d、7 d MDA含量均显著降低（P<0.05～0.01），SOD活力显著提高（P<0.05～0.01），脑水含量降低（均P<0.05）。结论 依达拉奉能降低实验性脑出血大鼠脑组织MDA含量、提高SOD活力、减轻脑水肿，对实验性脑出血大鼠有脑保护效应。

【关键词】  脑出血；丙二醛；超氧化物歧化酶；脑水含量；依达拉奉

    Effects of Edaravone on levels of malonaldehyde, superoxide dismutase and water content of cerebral tissue in intracerebral hemorrhage rats  ZHOU Hongjie,  ZHU Jie,  WANG Jingzhou, et al.Department of Neurology, Daping Hospital, Research Institute of Field Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

    Abstract：Objective  To study the effects of Edaravone on levels of reactive oxygen radicals and water content of cerebral tissue in intracerebral hemorrhage rats. Methods  Intracerebral hemorrhage  models of rat were made by injecting autologous blood using stereotaxic method. In Edaravone group, rats were treated with  Edaravone i.p. before and after intracerebral hemorrhage. The rats of intracerebral hemorrhage  group were not treated. Malonaldehyde (MDA) content of cerebral tissue was assaied by thiobarbituric acid method;  the activity of superoxide dismutase (SOD) was detected by xanthine oxidation. Brain water content was measured by drywet method.Results  In intracerebral hemorrhage  group, MDA content was significantly higher（P<0.01）, SOD activity was significantly lower（P<0.01） and brain water content increased clearly（P<0.05～0.01）, compared with control group. Compare with intracerebral hemorrhage  group, the MDA contents were much lower（P<0.05～0.01）, the SOD activities were much higher（P<0.05～0.01）and brain water contents were lower（all P<0.05）at 1 d,3 d,7 d after intracerebral hemorrhage   in Edaravone group.  Conclusion  Edaravone has brain protective effects on intracerebral hemorrhage rats  by scavenging MDA, increasing the SOD activity and inhibiting brain edema.

    Key words：intracerebral hemorrhage; malonaldehyde; superoxide dismutase; brain water content; Edaravone

      依达拉奉（Edaravone, MCI186）化学名3甲基1苯基2吡唑啉5酮，是一种具有捕获羟自由基的活性抗氧化剂，可抑制脑组织（血管内皮细胞，神经细胞）的过氧化作用［1］。目前已证实依达拉奉对缺血性脑损害具有明显的保护作用［2,3］，但依达拉奉对脑出血后脑损害保护作用的研究较少。脑出血引起的脑损害除早期血肿本身的占位效应外，尚与多种机制有关，氧自由基损害是其重要的病理生理机制之一。本研究制作大鼠实验性脑出血模型，观察自由基清除剂依达拉奉对实验性脑出血大鼠神经功能及血肿周围脑组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、脑水含量的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  健康雄性清洁级Wister大鼠54只，质量200～300 g，第三军医大学野战外科研究所动物中心提供; 随机分为脑出血组、依达拉奉组和对照组，每组18只; 每组又分为1 d、3 d、7 d 3个亚组（每组6只）。

    1.1.2  药物与试剂  依达拉奉（商品名必存，先声药业公司生产）; 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、MDA测定试剂盒、SOD试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

    1.2  方法

    1.2.1  模型制作及处理  脑出血组和依达拉奉组大鼠采用戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于立体定向仪（江湾1型）上，在头部背侧中央处剪去10 mm×10 mm头皮及皮下组织，于前囟前0.2 mm中线旁开4 mm处，用牙科钻钻一直径约1 mm的圆孔。在鼠尾末端约1 cm处剪断鼠尾，用微量注射器吸取新鲜血液约50 μl，微量注射器沿钻孔进针约6 mm，以20 μl/min 将50 μl血注入，注血后将针留置10 min，然后缓慢退针。对照组大鼠操作过程同上，但进针后不注血。依达拉奉组于术前30 min、术后每间隔12 h腹腔注射依达拉奉3 mg/kg。

    1.2.2  神经功能缺损评分  参照Longa 5级评分法，在各时间点进行神经功能缺失评分，0级：无体征，记0分; Ⅰ级：动物不能完全伸直其前肢，记1分;Ⅱ级：动物一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分; Ⅲ级：动物不能站立/打滚，记3分; Ⅳ级：无自发性活动，有意识障碍，记4分。

    1.2.3  脑水含量测定  在预定时间点将各组6只大鼠处死后取血肿周围脑组织约200 mg，置于电子天平称湿重（精确到0.1 mg），然后置于100℃恒温烘箱24 h称干重。按Blliot公式，脑水含量＝（湿重-干重）/湿重×100%。

    1.2.4  脑组织MDA、SOD检测  各组大鼠在预定时间点处死后取血肿周围脑组织约200 mg，匀浆离心后取上清液进行测定。MDA含量检测采用硫代巴比妥酸法。SOD活力检测采用黄嘌呤氧化法，其活力以每毫升上清液中SOD抑制率为50%时为1个亚硝酸单位，再按脑组织中的蛋白含量予以校正，换算成U/mg蛋白。检测过程严格按照马斯亮兰蛋白测定试剂盒、MDA测定试剂盒、SOD试剂盒说明书进行。

    1.2.5  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示，用SPSS 11.0软件，进行方差分析和t检验。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠神经功能缺损评分比较  见表1。脑出血组和依达拉奉组出血后1 d、3 d、7 d神经功能缺损评分均显著高于对照组（P<0.05～0.01）; 而依达拉奉组出血后3 d、7 d显著低于脑出血组（均P<0.05）。

    2.2  3组大鼠脑水含量的比较  见表2。脑出血组各时间点亚组大鼠脑水含量均比对照组显著增高（P<0.05～0.01）；依达拉奉组出血后1 d、3 d大鼠脑水含量显著高于对照组（均P<0.05），出血后7 d与对照组比较差异无统计学意义。依达拉奉组各时间点亚组大鼠脑水含量较脑出血组显著降低（均P<0.05）。表1  3组大鼠神经功能缺损评分比较  注：与对照组比较*Ｐ<0.05,**Ｐ<0.01；与脑出血组比较△P<0.05

    表2  3组大鼠脑水含量的比较 注：与对照组比较*Ｐ<0.05,**Ｐ<0.01；与脑出血组比较△P<0.05

    2.3  3组大鼠脑组织MDA含量、SOD活力的比较  见表3。脑出血组和依达拉奉组各时间点亚组大鼠脑组织MDA含量均较对照组显著增高（P<0.05～0.01），依达拉奉组各时间点亚组MDA含量均显著低于脑出血组（P<0.05～0.01）。脑出血组和依达拉奉组各时间点亚组大鼠脑组织SOD活力均较对照组显著降低（P<0.05～0.01），依达拉奉组各时间点亚组大鼠脑组织SOD活力显著高于脑出血组（P<0.05～0.01）。

    表3  3组大鼠脑组织MDA含量及SOD活力的比较注：与对照组比较*P<0.05，** P<0.01；与脑出血组比较△P<0.05，△△P<0.01

    3  讨  论

    氧自由基在脑出血继发性脑损害中起重要的作用，脑出血时由于血肿压迫周围脑组织和微血管，病灶周围存在大范围低灌注区，产生大量超氧阴离子自由基［6］；同时损伤区发生明显炎性反应［7,8］，激活的多形核白细胞也产生大量氧自由基。所产生的自由基除了可使蛋白质及其他有机分子变性外，还可与细胞脂质的疏水部分反应生成脂质自由基，通过过氧化反应，破坏细胞膜，损害细胞完整性，最终造成细胞广泛损伤产生脑水肿。自由基还可导致脑组织微血管内皮细胞坏死，引起脑血管通透性增加，进一步加重脑水肿［9］。MDA为众多脂质氧化物的一种，是脂质过氧化物的稳定代谢产物，代表自由基攻击神经细胞造成脂质过氧化的程度。SOD是广泛存在于生物体内的金属酶，能催化超氧阴离子的歧化反应，是体内非常重要的氧自由基清除剂，代表机体抵抗自由基攻击、清除自由基的能力。本实验结果显示，脑出血大鼠出现神经功能缺损同时，脑水含量增加，脑组织MDA含量显著增高、SOD活力显著下降，提示脑出血时脂质过氧化反应增强，抗自由基酶活力下降，进一步显示自由基与脑出血后脑组织的损伤有关。

    依达拉奉是亲脂性基团，血脑屏障通透率为60%，作为新开发的一种活性抗氧化剂，已广泛用于急性脑梗死的治疗并取得较好的疗效［3,4］。本实验将自由基清除剂依达拉奉用于脑出血大鼠，结果显示依达拉奉组与脑出血组比较，脑组织MDA含量明显降低，SOD活力增高，脑水含量降低，并且与偏瘫相关的神经功能缺损评分亦明显降低，表明依达拉奉对脑出血后的脑损害有一定疗效。其作用机制可能为依达拉奉作为自由基清除剂能抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性，剌激前列环素的生成，减少炎性介质白细胞三烯的生成，降低羟自由基的浓度，对抗羟自由基及铁离子引起的脂质过氧化活性。同时依达拉奉还能抑制血管内皮细胞的损害，减轻脑水肿，改善神经功能。

    本研究结果提示依达拉奉针对脑出血后自由基参与的病理生理过程，可有效减轻脑出血后的脑组织损害，改善脑神经功能。

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