天舒胶囊对偏头痛大鼠血浆β内啡肽、五羟色胺 含量及其脑组织cfos表达的影响

作者：杨天华，张勤，周沐科，刘永宏，周东    作者单位：610041成都，四川大学华西医院神经内科

【摘要】  目的 研究天舒胶囊对偏头痛大鼠血浆β内啡肽（βEP）、五羟色胺（5HT）含量及其脑组织cfos表达的影响。方法 皮下注射硝酸甘油建立偏头痛大鼠模型，给予天舒胶囊高、中、低剂量灌胃（剂量为7.5 g/kg、3.75 g/kg和1.88 g/kg），按治疗和预防两种方式给药。空白对照组和模型组予以相应剂量的生理盐水灌胃。采用放免法和高效液相色谱法分别测定大鼠静脉血中βEP、5HT含量；免疫组化染色观察中脑导水管周围灰质βEP、5HT和cfos阳性表达。结果 与模型组比较，天舒胶囊高剂量治疗和预防组、中剂量预防组血浆βEP水平明显升高（均P<0.05），天舒胶囊高、中、低剂量治疗和预防组血浆5HT水平明显降低（均P<0.05）；天舒胶囊中剂量治疗和预防组中脑导水管周围灰质cfos表达明显降低（均P<0.05），而βEP、5HT表达增高（均P<0.05）。结论 天舒胶囊可改善偏头痛发作时血管活性物质和神经递质水平失常，从而改善偏头痛症状。

【关键词】  天舒胶囊；β内啡肽；5羟色胺；cfos；偏头痛

    Effects of Tianshu capsule on the plasma levels of βendorphin and 5Hydroxytryptamine and cfos expression of brain tissue in rats with migraine  YANG Tianhua, ZHANG Qin, ZHOU Muke, et al. Department of Neurology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China

    Abstract：Objective  To investigate the effects of Tianshu capsule (TSC) on the plasma levels of βendorphin (βEP) and 5Hydroxytryptamine (5HT) and cfos expression of brain tissue in the rat with migraine.Methods  The rat migraine model was established by subcutaneously administration of nitroglycerin. The intragastric administration dose of TSC was divided into three groups as follows: high dose (7.5 g/kg), middle dose (3.75 g/kg) and low dose (1.88 g/kg). TSC was administrated respectively in therapeutic and prophylactic model. The control group and model group were administrated corresponding dose of normal saline. The plasma levels of βEP and 5HT in rat were measured by radioimmunoassay and HPLC respectively; the distribution of βEP, 5HT and cfos in rats periaqueductal grey were evaluated by immunohistochemistry.Results  Compared to model group, the plasma levels of βEP were increased remarkably in high dose TSC therapeutic and prophylactic groups,middle dose prophylactic group (all P<0.05), and the plasma levels of 5HT were decreased in all the three dose TSC therapeutic and prophylactic groups(all P<0.05). The cfos expression were decreased(all P<0.05) and the expression of βEP and 5HT were increased in periaqueductal grey in middle dose TSC therapeutic and prophylactic groups (all P<0.05).Conclusion  TSC can modulate the unbalance of vasoactive substances and neurotransmitters during the migraine attacks, and improve the symptom of migraine.

    Key words：Tianshu capsule;βendorphin ;5Hydroxytryptamine；cfos; migraine

　  天舒胶囊临床用于治疗和预防偏头痛均有一定疗效；我们前期实验发现，无论是以治疗方式还是预防方式给予天舒胶囊，均在一定程度上改善神经递质和血管活性物质水平失常，从而调节脑和血管功能紊乱，这和其改善偏头痛症状的作用有关。本实验拟通过观察天舒胶囊对大鼠偏头痛模型血浆中β内啡肽（βEP）、五羟色胺（5HT）含量及其对大鼠中脑导水管周围灰质βEP、5HT和cfos表达的影响，以探讨天舒胶囊预防和治疗偏头痛的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  SD大鼠50只（四川大学实验动物中心），雌雄各半，质量（200±50）g，随机分为空白对照组、偏头痛模型组、天舒胶囊高、中、低剂量组，每组10只，其中5只为治疗模型，5只为预防模型。

    1.1.2  药物与试剂、仪器  天舒胶囊（江苏康缘药业股份有限公司，0.34 g/粒）；硝酸甘油注射液（北京益民药业有限公司，5 mg/ml）；5HT 标准品(Sigma公司)；βEP 放免分析试剂盒（北京华英生物技术研究所）；兔抗大鼠βEP抗体，兔抗大鼠5HT 抗体，兔抗大鼠cfos抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。γ闪烁计数仪，高效液相色谱仪。

    1.2  方法

    1.2.1  偏头痛模型建立及药物干预  予以大鼠皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，制作偏头痛模型［1］；空白对照组皮下注射相应剂量95％乙醇。天舒胶囊高、中、低剂量组大鼠给予天舒胶囊（7.5 g/kg，3.75 g/kg和1.88 g/kg）灌胃，分别相当于临床用量的10、5和2.5倍；空白对照组和偏头痛模型组予以相应剂量的生理盐水灌胃。治疗组建模后30 min给予天舒胶囊灌胃给药1次；预防组先连续3 d每日灌胃给药1次, 于第3 d给药后30 min建模。

    1.2.2  βEP、5HT、cfos检测  大鼠制模后1 d给1%戊巴比妥钠30 mg/ kg 腹腔注射麻醉后采静脉血约6 ml。其中3 ml置入预冷的试管中，每ml全血加入40000 U/ml抑肽酶10 μl、10%EDTANa2 15 μl，混匀后4℃、3000 r/min离心10 min，分离血浆置-70℃保存，用于βEP 的测定。另3 ml全血加入含肝素锂的真空采血管中，混匀后1500 r/min离心10 min，分离血浆，每500 μl血浆加入25 μl焦亚硫酸钠，混匀后-70℃保存，用于5HT的测定。以放免法测定血浆βEP水平，以高效液相色谱法测定5HT水平，操作均按试剂盒说明书进行。天舒胶囊中剂量组、偏头痛模型组及空白对照组大鼠用4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS灌注固定后取脑，按《大鼠脑立体定位图谱》，于前囟后方6.6～7.6 mm之间(中脑导水管周围灰质)连续冠状切片，片厚20 μm，隔5张取1张。免疫组化染色用ABC法，抗体滴度均为1∶100。在40倍物镜下盲法计数每张切片相应区域5个不同视野βEP、5HT阳性细胞（细胞浆呈棕褐色）和cfos阳性细胞（细胞核呈棕褐色）数，计算每个视野平均阳性细胞数。

    1.2.3  统计学方法  检测结果以均数±标准差(±s)表示，使用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,组间两两比较用Student t检验。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠血浆βEP和5HT浓度比较  见表1。与偏头痛模型组比较，天舒胶囊高剂量治疗和预防组及中剂量预防组血浆βEP水平明显升高(均P<0.05)，天舒胶囊高、中、低剂量治疗和预防组血浆5HT均明显降低(均P<0.05)。表1  各组大鼠血浆βEP和5HT浓度的比较 注：与空白对照组比较*P<0.05；与偏头痛模型组比较△ P<0.05

    2.2  各组大鼠中脑导水管周围灰质βEP、5HT和cfos阳性细胞数比较  见表2。与偏头痛模型组比较，天舒胶囊中剂量治疗和预防组中脑导水管周围灰质cfos阳性细胞数明显减少，而βEP、5HT阳性细胞数明显增多(均P<0.05)。表2  各组大鼠中脑导水管周围灰质βEP、5HT和cfos阳性细胞数比较 注：与空白对照组比较*P<0.05；与偏头痛模型组比较△P<0.05

    3  讨  论

    偏头痛的发病机制尚无定论，目前有三叉神经血管学说、炎症反应学说、皮质扩散抑制学说等；此外，偏头痛与内源性阿片肽系统功能紊乱和5HT 代谢紊乱有关［2，3］。本研究采用大鼠偏头痛模型观察天舒胶囊对其血浆5HT、βEP含量以及对脑组织5HT、βEP及cfos表达的影响。

    5HT分布广泛，90%存在于胃肠道的嗜酸细胞，其余分布在血小板（8%）和中枢神经系统（1%～2%）。血液中的 5HT 几乎全部位于血小板致密体中，在血小板活化时释出。血浆中游离的5HT 很少，在偏头痛发作起始期，其释放异常增加。5HT 受体分为多种亚型，结合不同亚型受体5HT可以产生不同的生物学效应。在低浓度时，对5HT1B/1D受体具有较高亲和力；而在高浓度时则对5HT2A受体有高亲和力。在偏头痛发作间期，主要结合5HT1B/1D受体，导致血管收缩并稳定血管周围伤害性感受器和中枢伤害性感受神经元。而当5HT过度释放时主要结合5HT2A受体导致一氧化氮增加，进而导致血管舒张，致敏血管周围和肌筋膜的伤害性感受器和中枢伤害性感受神经元，从而导致偏头痛发作［3］。其他受体如5HT2B 和 5HT2C的激活可能也参与了偏头痛发作［4，5］。5HT1B/1D受体激动剂舒马曲坦能减低硝酸甘油导致的三叉神经通路区域炎性介质神经型一氧化氮合酶（nNOS）的表达［6］, 其还可以通过降低患者血浆降钙素基因相关肽（CGRP）水平或阻断CGRP的作用，使头痛缓解［7,8］。本实验发现，无论是以治疗还是预防方式给予偏头痛大鼠天舒胶囊，均可以抑制其血浆5HT水平升高，这可能与其抑制血小板激活有关［9］；另外还见中脑导水管周围灰质5HT的激活，这可能与天舒胶囊刺激脑干中缝背核，激活5HT下行镇痛系统有关，从而参与疼痛调节。

    βEP是体内镇痛系统的主要递质,具有吗啡样的镇痛作用。βEP主要在脊髓以上水平通过激动第三脑室及中脑导水管周围灰质，再兴奋中缝大核的 5HT 能神经元经脊髓背外侧索下行的下行抑制系统，调节脊髓背角和三叉神经脊束核相应部位感觉神经元对伤害性刺激的感受程度［10］。偏头痛患者内啡肽系统障碍，βEP 释放减少，神经系统的稳态不能维持，对外界刺激过于敏感，致偏头痛发作［1113］。而且βEP 减少对脑干蓝斑的抑制减弱，使多种血管活性物质释放，导致脑血管舒缩功能紊乱，偏头痛发作。本实验发现，无论是以治疗（高剂量）还是预防方式（高、中剂量）给予偏头痛大鼠天舒胶囊，均可以增加血浆βEP的水平，同时还可以上调中脑导水管周围灰质βEP的表达。

    cfos是一种存在于正常神经元细胞核内的即刻早期基因。正常情况下，细胞内 cfos 很少表达，各种伤害性刺激（包括疼痛、创伤等）均可诱导中枢神经系统cfos的表达，其表达水平与痛觉调控密切相关。cfos 蛋白的表达可以作为伤害感受性的标记，并且可以区分伤害刺激激活的相应神经元亚群。目前认为，伤害性刺激引起 cfos 表达后可能是通过启动脊髓内源性抑制系统对抗过度的刺激，在痛觉调控中发挥重要作用的阿片肽基因可能是cfos 的靶基因之一。cfos 表达将外界刺激引起的第二信使介导的短时程信号在基因表达上转换成长时程信号，在痛觉引起的突触可塑性变化中起重要作用。本实验显示，在给予偏头痛模型大鼠天舒胶囊后，其中脑导水管周围灰质cfos蛋白的表达明显降低，提示天舒胶囊能降低中枢痛觉阈值，进一步抑制伤害性痛觉信息的传递，从而减轻偏头痛症状。

    综上所述，以治疗方式或预防方式给予偏头痛大鼠模型天舒胶囊治疗，在一定程度上平衡了与疼痛相关的神经递质、神经肽及血管活性物质水平，调节脑和血管的功能，这可能是其改善偏头痛症状的机制。

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