氯胺酮对糖尿病周围神经病变大鼠脊髓GFAP表达的影响

　　作者：杨京利，马国平，刘菊英，周青山 作者单位：1郧阳医学院附属太和医院麻醉科, 湖北 十堰　442000; 2湖北省人民医院麻醉科， 湖北 武汉 430060

　　【摘要】目的：探讨氯胺酮对糖尿病周围神经病变大鼠脊髓的保护作用。方法：对糖尿病周围神经病变大鼠腹腔注射氯胺酮，于注射后第1、3、5、8周观察其行为学及神经传导速度的改变;应用免疫组化方法和图象分析法检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在脊髓背角的表达情况。结果：糖尿病周围神经病变引起大鼠机械性触诱发痛;大鼠脊髓背角组织中GFAP的表达明显增强;其腹腔注射氯胺酮后GFAP在脊髓背角的表达减弱。结论：糖尿病大鼠周围神经病变引起的神经痛与脊髓背角胶质细胞激活有关。而氯胺酮可明显抑制脊髓背角胶质细胞的激活，减轻糖尿病神经痛。

　　【关键词】 氯胺酮;脊髓;糖尿病神经痛;胶质纤维酸性蛋白

　　Effects of Ketamine on the Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein in the Spinal Cord in Peripheral Neuropathy of Diabetic Rats

　　YANG Jing-li, MA Guo-ping, LIU Ju-ying, ZHOU Qing-shan

　　Department of Anesthesiology, 1Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000; 2Hubei Renmin Hospitol, Wuhan, Hubei 430060,China

　　Abstract：Objective To evaluate the effect of ketamine on glial fibrillary acidic protein(GFAP) in the spinal dorsal horn in peripheral neuropathy of diabetic rats. Methods Diabetic rats induced by STZ were divided into three groups randomly. All groups were tested for pain behaviors using the Von Frey test at 1, 3, 5 and 8 weeks after surgery, and at the eighth week, electrophysiological measurement of sciatic nerve was performed. Changes of GFAP expression was detected with immunohistochemistry staining. Results The expression of GFAP in spinal cord in diabetes group and ketamine group were significantly higher than that in the normal control group(P<0.01), the GFAP expression in the ketamine group was significantly lower than that in the diabete group(P<0.01), the result of behavioural assessment in diabetes group and ketamine group was markedly deteriorated than that in control group(P<0.01). Conclusion The peripheral neuropathy of diabetic rats can lead to GFAP overexpression in the spinal cord, which is associated with the development and maintenance of neuropathic pain. Ketamine can effectively reduce GFAP expression, which is important to relieve pain, and play a protective role in peripheral neuropathy of diabetes.

　　Key words: Ketamine; Spinal cord; Diabetes neuropathies; Glial fibrillary acidic protein

　　神经源性疼痛(neuropathic pain)是指由中枢或外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征。临床常见的有糖尿病性神经痛、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛和脊髓损伤后神经痛等。糖尿病神经痛是最常见的神经痛之一[1]。此类疼痛难以治疗，是麻醉临床和基础研究的前沿课题。传统观念认为神经源性疼痛与其他感觉现象一样，是由单纯的神经元功能改变引起的。但是胶质细胞对疼痛具有放大作用这一发现改变了传统观念。氯胺酮是临床上常用的静脉麻醉药，近来有报道氯胺酮可重复刺激脊髓背角C神经纤维而结束中枢神经系统的敏感状态，这使得人们对应用氯胺酮进行疼痛治疗产生了很大兴趣[2-3]。本研究通过链脲菌素(strep tozotocin，STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，观察其周围神经病变进程及神经电生理改变;并探讨氯胺酮对糖尿病神经痛大鼠的脊髓保护作用，以探讨氯胺酮对胶质细胞激活的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂与抗体

　　链脲菌素(STZ,美国Sigma公司)溶于0.1 mol/L枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液中，pH4.5。GFAP多克隆抗体购自上海晶美生物技术有限公司。

　　1.2 实验动物及分组

　　健康Wistar雌性大鼠70只，体重180~220 g，SPF级，由武汉大学实验动物中心提供，室温20 ℃~25 ℃，照明周期为12/12 h，自由饮水、饮食。随机留取10只大鼠作为正常对照组，其余60只大鼠禁食12 h后按75 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液。3 d后开始用血糖分析仪测定大鼠尾静脉血糖，参照文献[4]，待空腹血糖>16.7 mmol/L、稳定2周的大鼠为成功糖尿病大鼠模型，共得到48只糖尿病大鼠。

　　将实验动物随机分为3组：正常对照组(n=10)：仅腹腔注射生理盐水(3 mL·kg-1·d-1)。糖尿病大鼠随机等分为2组：糖尿病组(n=24)：腹腔注射与对照组等体积生理盐水;氯胺酮组(n=24)：腹腔注射氯胺酮10 mg/kg(1 mg/mL)，分别注射1，3，5，8周。所有操作在下午2时～3时完成。

　　1.3 行为学测定

　　机械性痛觉的测定：治疗后1、3、5、8周(上午9时～11时测定)将大鼠置于升高的金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。先让大鼠适应环境15 min，待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的Von Frey 纤维垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成“S”形，持续6~8 s，观察是否出现缩足反应。大鼠在刺激时间内或在移开Von Frey 纤维时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，而身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应。每隔5 s测一次，连测10次，诱发4~6次缩足的阈值作为50%反应率。

　　1.4 神经电生理测定

　　术后8 周大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，俯卧位固定后，用肌电诱发电位仪(Viking VD型，美尼高利公司生产)测定右后肢坐骨神经的传导速度。神经传导速度的刺激点：腘窝;记录点：腓肠肌;刺激频率1.0 Hz，刺激强度90 V。

　　1.5组织学标本采集

　　实验动物分别于腹腔注射后1、3、5、8周(每时点分别取6只大鼠)用10 g/L水合氯醛分批麻醉下剖胸暴露心脏，经右心室插管灌流固定，先用约200 mL生理盐水冲洗至流出液澄清，再用500 mL的4 g/L多聚甲醛灌流固定，取L4~6段脊髓组织置于30 g/L多聚甲醛液中固定24 h，常规石蜡包埋，3 μm连续切片，分别行HE和GFAP免疫组化染色，部分切片用于对照试验。

　　1.6 GFAP免疫组织化学检测

　　取各时间点标本做免疫组织化学染色，用SABC法检测GFAP。随机抽样取上述切片数张,以PBS代替GFAP多克隆抗体作为阴性对照。

　　1.7 图像分析观察

　　GFAP以细胞质以及突起上呈棕黄色为阳性。采用HPIAS-2000彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像公司)，每张切片随机选取5个不重叠视野，测定阳性染色的平均灰度。

　　1.8 统计学分析

　　计量数据以均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS 11.0统计软件包进行单因素方差分析、组间t检验,P<0.05表示差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠的痛觉及神经传导速度的变化

　　治疗后1周糖尿病组痛阈为(6.25±1.00) g，与正常对照组比较有显著性差异，此后各时间点均有显著性差异，且疼痛阈值随时间降低;氯胺酮组在治疗后3周时与对照组和糖尿病组各相应时点值比较有显著性差异(P<0.05);氯胺酮治疗后8周氯胺酮组的疼痛阈值已经恢复至基线，而糖尿病组阈值仍较低，两者之间差异有显著性(P<0.01)。氯胺酮组8周肌电诱发电位测定：对照组、氯胺酮组其右后肢坐骨神经肌电诱发电位的潜伏期、传导速度和振幅与糖尿病组比较差异有显著性(P<0.05)。氯胺酮组与对照组差异无显著性(见表1~2)。

　　2.2 脊髓病理学改变

　　HE染色显示正常对照组无明显病理改变。糖尿病组大鼠脊髓明显萎缩，脊髓灰质不呈现蝴蝶状，而是逐渐变圆，神经元数目减少，出现明显胶质化(图1~2)。

　　2.3 脊髓背角GFAP阳性染色平均灰度的变化

　　正常对照组可见少量散在分布的GFAP阳性表达细胞，多呈扁平的不规则多角形形态，星状突起纤细，染色较弱，GFAP分布于胞浆及星状突起中。糖尿病组GFAP阳性表达明显增多, 单个阳性细胞的染色强度增大，胞体增大，突起远端增粗，分支减少。氯胺酮组内的阳性染色增强，形态各异，染色较糖尿病组弱(表3，图3~5)。

　　胶质细胞是神经系统的辅助细胞，传统观念认为它不参与细胞间信号传导及痛觉调控过程。随着疼痛研究的不断深入，人们发现脊髓神经胶质细胞在病理性痛的发生和维持中发挥重要作用[5]。脊髓胶质细胞对周围神经、大脑和脊髓免疫激活的信号作出反应而被激活，产生和释放的致痛物质，经过一系列生化和病理反应，最后通过兴奋疼痛传递神经元诱发病理性疼痛[6-7]。GFAP存在于正常星形胶质细胞(AS)和反应性星形胶质细胞中，特异性地表达于AS, GFAP主要用于标记损伤后胶质反应[8]。GFAP免疫反应增强表明星形胶质细胞被活化，其表达的高低可间接反映AS增殖、肥大、坏死等改变程度。中枢神经系统损伤后可以促进AS的肥大、增生和迁移，形成反应性星形细胞胶质化[9]。各种中枢神经系统损伤都可引起星形胶质细胞分支增多，损伤后增生的GFAP阳性星形胶质细胞能促进星形胶质细胞有丝分裂，使原始祖细胞分化到成熟的星形胶质细胞[10]。

　　本实验发现糖尿病神经痛大鼠脊髓明显萎缩，脊髓灰质逐渐变圆，神经元数目减少，出现明显胶质化。此病理改变说明糖尿病引起了大鼠中枢神经系统的损伤，引起脊髓背角胶质细胞活化，进而大鼠出现机械痛阈降低。这与脊髓胶质细胞激活介导病理性疼痛，并在病理性疼痛的发生和维持中起重要作用的理论一致。

　　氯胺酮在临床上主要用于静脉麻醉，可抑制伤害性刺激引起的运动反应[11]。氯胺酮是否可以通过影响脊髓水平的伤害性信息的传递而发挥抗伤害作用尚不清楚[12]。当病毒和细菌入侵时，被激活的胶质细胞与其他免疫细胞一样，释放促炎性细胞因子，包括IL-1β，IL-6，TNF-α 。这些免疫蛋白与非病理性疼痛无关，而通过对脊神经的作用参与病理性疼痛的发生。 已有许多报道证实氯胺酮能抑制促炎性细胞因子，如TNF-α、IL-6的表达[13-14]。本实验显示在相同的时间点和相同的部位，氯胺酮组大鼠脊髓GFAP的表达明显弱于糖尿病组，由此推断氯胺酮通过抑制糖尿病大鼠脊髓胶质细胞的激活，影响致痛因子的表达,从而对糖尿病神经痛起到一定的抑制作用。

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