异丙酚对全身高温所致大鼠认知障碍和海马神经元凋亡的影响

　　作者：卜祥梅 赵 鑫 江淼 王志刚 作者单位：山东大学第二医院麻醉科，山东 济南 250012

　　【摘要】目的 观察异丙酚对全身高温(whole body hyperthermia,WBH)导致的老年大鼠认知功能障碍和海马区神经元凋亡的影响。方法 采用热辐射法建立大鼠WBH模型，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测海马神经元凋亡，免疫组织化学法检测海马神经元天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)蛋白的表达;用Morris水迷宫试验检测大鼠的认知功能。结果 WBH过程中用异丙酚麻醉，能够减少海马神经元caspase3蛋白的表达和海马神经元的凋亡，减轻大鼠的认知障碍。结论 异丙酚能减少WBH引起的大鼠海马神经元凋亡，减轻WBH导致的大鼠认知功能障碍。

　　【关键词】 细胞凋亡 认知障碍 海马 水迷宫 全身高温

　　Effects of propofol on whole body hyperthermiainduced cognitive handicap and hippocampus neurons apoptosis in rats

　　BU XiangMei , ZHAO Xin, JIANG Miao, et al.

　　Department of Anesthesiology, the Second Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China

　　【Abstract】Objective To investigate the effects of propofol on whole body hyperthermia (WBH)induced cognitive handicap and hippocampus neurons apoptosis in rats. Methods WBH rat model was established by radiantheat method to detect hippocampus neuron apoptosis by TUNEL and caspases3 expression by immunohistochemical method and cognition function by Morris water maze. Results Anesthesia with propofol during WBH decreased caspase3 protein expression and neuron apoptosis in hippocampus and alleviated cognitive handicap. Conclusions Propofol can decrease hippocampus neurons apoptosis and caspase3 expression and alleviate cognitive handicap induced by WBH.

　　【Key words】Apoptosis; Cognitive handicap; Hippocampus; Morris water maze; Whole body hyperthermia

　　恶性肿瘤全身转移是老年人死亡的重要原因之一。全身高温(WBH)是治疗转移肿瘤的新方法，它与放疗、化疗〔1〕以及免疫治疗〔2〕联合应用可以提高以上疗法的效果。WBH在杀伤肿瘤的同时可引起机体正常细胞的损伤，临床常见患者WBH后出现疲劳、认知障碍、恶心等症状。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)是一类和凋亡密切相关的调节基因，是启动和执行哺乳动物细胞凋亡的最关键的凋亡蛋白，在所有的caspase的蛋白分子中，caspase3 在细胞的凋亡中起着最后枢纽的作用〔3〕。海马区神经元对于全脑缺血最敏感，首先出现损害〔4〕，因此我们选取海马区神经元作为本次实验的研究对象。麻醉药品异丙酚被公认对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但是异丙酚对于WBH引起的脑损伤有无保护作用尚不明确。本研究通过建立WBH大鼠模型，观察异丙酚对WBH导致的脑损伤的保护作用，为预防和减轻WBH的并发症提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　健康雄性Wistar大鼠60只，清洁级，年龄10～12个月，体重350～450 g，由山东大学实验动物中心提供(质量合格证号：0001487)。

　　1.1.2 药品与试剂

　　丙泊酚注射液由四川蜀乐药业有限公司提供(50 ml,0.5 g,产品批号：0703192);10%水合氯醛由山东齐鲁制药厂生产(产品批号：061101);兔抗鼠caspase3单克隆抗体(一抗)、羊抗兔(二抗)、SABC(链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物)、DAB显色试剂盒、TUNEL试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。

　　1.1.3 实验仪器

　　HKN93A型婴儿辐射保温台由宁波戴维医疗器械有限公司生产;Morris水迷宫试验系统由山东省中医药大学提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组与WBH模型制作

　　将大鼠随机分为3组(n=20)：水合氯醛高温组、异丙酚高温组、空白对照组。水合氯醛高温组和异丙酚高温组大鼠分别用10%水合氯醛3.5 ml/kg和异丙酚150 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于鼠板上。将电子温度计探头插入大鼠直肠，深度为3～4 cm。用婴儿辐射保温台照射使大鼠升温至42℃，并保持42℃30 min。高温过程中用微量泵以16 ml·kg-1·h-1的速度腹腔补充平衡盐液。空白对照组为正常大鼠，不进行WBH处理。

　　1.2.2 标本处理

　　24 h后，各组随机处死10只大鼠。腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉，常规胸腹联合切口，右心耳剪一小切口，经心尖将灌注针插入主动脉，依次用生理盐水200 ml、4℃ 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液200 ml灌注固定。断头取脑，在视交叉后1～4 mm之间冠状切面切开，取中间脑组织，在海马齿状回平面连续冠状冰冻切片，片厚4 μm。

　　1.2.2.1 TUNEL法检测神经元凋亡

　　采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测神经元凋亡。按说明书操作，DAB显色，光镜下观察，细胞核中出现棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每只动物取3张连续切片，每张切片高倍镜下(400×)选取海马CA1、CA2和齿状回3个区域，分别连续计数100个神经元细胞、计数TUNEL阳性细胞个数平均值，凋亡率=TUNEL阳性细胞数%。

　　1.2.2.2 免疫组化检测caspase3蛋白

　　按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下观察，细胞核或者胞浆中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阴性对照：用PBS 代替caspase3一抗，余步骤同前，结果为阴性。显微镜高倍视野连续观察200个神经元细胞，其中细胞核内和细胞浆内均见棕褐色颗粒者为强阳性细胞，记3分;细胞浆内见棕黄色颗粒为阳性细胞，记2分;细胞浆内见淡黄色颗粒为弱阳性细胞，记1分，阳性评分=强阳性细胞个数×3+中阳性细胞个数×2+弱阳性细胞个数×1。

　　1.2.3 Morris水迷宫试验

　　水迷宫为直径130 cm、高50 cm的圆形水池，水深30 cm，水温保持(22±1)℃，水面均匀覆盖一层大小相似的泡沫颗粒。池壁上标有东南西北4 个入水点，它们将水等分为SW、NW、SE 及NE 4 个象限，在SW象限正中离池壁25 cm放一个直径为10 cm、高29 cm的圆形透明平台，平台顶低于水面1 cm。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。训练期间迷宫外参照物保持不变。各组均于WBH后第3天开始进行Morris水迷宫行为测定，试验历时6 d。

　　1.2.3.1 定位航行试验(place navigation test)

　　用于测量大鼠空间学习和记忆的能力。本试验从大鼠WHB后第3天开始。试验开始前1 d让大鼠自由游泳2 min;从水迷宫试验第1天起至第6天，每天分上、下午2时段，每段训练4 次，分别从4个不同的入水点入水，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间(逃逸潜伏期)。如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台，这时逃逸潜伏期记为120 s，每次训练间隔20 s。

　　1.2.3.2 空间搜索试验(spatial probe test)

　　用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力。在水迷宫试验第6天的下午撤除平台，记录大鼠120 s内的游泳轨迹，计算其跨越平台次数(穿环指数)。

　　1.3 统计学分析

　　数据用x±s表示，用SPSS10.0统计软件进行秩和检验和方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组海马神经细胞凋亡率

　　凋亡细胞胞核染色质浓缩、边聚，附着于核膜内表面，成新月形或环状，有凋亡小体形成。空白对照组海马区极少见到凋亡神经元，凋亡率为(1.1±0.7)%，而水合氯醛高温组〔(13.4±3.0)%〕和异丙酚高温组〔(10.1±3.5)%〕的凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05)。且两组间差别显著(P<0.05)，见图1。

　　2.2 各组海马神经元caspase3蛋白表达

　　空白对照组海马神经元仅可见少量caspase3弱阳性神经元，阳性神经元评分为(2.9±1.7)。水合氯醛高温组和异丙酚高温组可见大量caspase3阳性神经元，其阳性神经元评分与空白对照组比较差别显著(P<0.01)。水合氯醛高温组caspase3阳性神经元评分(42.1±12.4)分和异丙酚高温组caspase3阳性神经元评分(30.2±10.3)分的差别显著(P<0.05)，图2。

　　2.3 Morris水迷宫试验

　　定位航行试验在前2 d内，各组大鼠逃逸潜伏期差别无统计学意义。第3、4、5天，与空白对照组相比，异丙酚高温组逃逸潜伏期延长(P<0.05)，水合氯醛高温组逃逸潜伏期也延长(P<0.01);异丙酚高温组逃逸潜伏期较水合氯醛高温组缩短(P<0.05)，空间搜索试验中，与空白对照组相比，水合氯醛高温组穿环指数降低(P<0.01)，异丙酚高温组穿环指数也降低(P<0.05);异丙酚高温组穿环指数大于水合氯醛高温组(P<0.05)。见表1。表2 各组大鼠逃逸潜伏期和穿环指数的比较(略)

　　3 讨 论

　　WBH是使用约42℃的高温加热机体，以杀灭肿瘤细胞和促进肿瘤细胞凋亡。WBH在杀灭肿瘤细胞的同时也会损伤机体正常细胞,引起各种并发症，其中脑组织损伤引起的认知功能障碍最为严重。Morris水迷宫试验是评估大鼠认知功能的经典测试系统〔5〕。本研究中发现异丙酚高温组和水合氯醛高温组大鼠的学习记忆能力，与空白对照组大鼠相比均降低，说明WBH引起老年大鼠学习记忆能力的损伤。

　　海马是学习记忆的关键结构，海马神经元丢失可导致大鼠学习和记忆能力下降。本研究发现WBH后海马出现大量caspase3阳性神经元和凋亡神经元，因此推测WBH引起的认知功能障碍跟海马区神经元的凋亡有关。WBH 41～42℃时，脑组织的血流和代谢都发生了改变。Nunneley等〔6〕对正常人体研究，发现加热20 min可引起脑总体的基本代谢率升高23%。WBH时机体全身血管扩张，有些动物WBH后5～10 min即可出现平均动脉压降低至60～65 mmHg，接近或者低于脑血管自身调节的低限。因此，WBH时脑组织处于缺血缺氧状态，一方面可导致兴奋性氨基酸过度释放，造成神经细胞内Ca2+超载，导致神经细胞的磷脂膜、细胞骨架蛋白、核酸等破坏，激活下游caspase3，启动细胞凋亡;另一方面是脑缺血后神经细胞内能量不足，产生过多的自由基和代谢产物，直接损害细胞质膜，激活caspase3，启动细胞凋亡。

　　异丙酚是一种具有脑保护的麻醉药，在以往研究〔7〕中发现，异丙酚对于大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。水合氯醛在以往文献报道中未见其有脑保护作用，因此本研究中采用水合氯醛对比。本研究发现异丙酚高温组学习记忆能力损伤较水合氯醛高温组减轻，且异丙酚高温组海马神经元caspase3表达及凋亡神经元均较水合氯醛高温组减少，说明异丙酚能减轻WBH引起的神经元损伤。其脑保护作用可能是通过以下途径实现的：①异丙酚具有酚羟基结构，和维生素E一样具有抗氧化作用，维生素E能清除氧自由基，拮抗神经元的过氧化损伤〔8〕;②异丙酚还可明显减少兴奋性氨基酸谷氨酸递质的释放〔9〕，减轻兴奋性氨基酸谷氨酸递质引起的脑损伤;③异丙酚还可通过调节凋亡相关蛋白的表达，如影响Bcl2/Bax值，减轻肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡〔10〕、减轻caspase3活性，拮抗细胞凋亡〔11〕。

　　【参考文献】

　　1 Vertrees RA，Das GC，Popov VL,et al.Synergistic interaction of hyperthermia and gemcitabine in lung cancer〔J〕.Cancer Biol Ther,2005;4(10):114453.

　　2 Takeda T，Dong X，Takeda H,et al.Successful immunotherapy combined with hyperthermia therapy for cancer patients〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2006;33(12)：173941.

　　3 Park HJ，Kim YJ，Leem K,et al.Coptis japonica root extract induces apoptosis through caspase3 activation in SNU668 human gastric cancer cells〔J〕.Phytother Res，2005;19 (3)：18992.

　　4 刘 伟，孟宪琴.全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征〔J〕.医学临床研究,2007;24(6)：9025.

　　5 Wang Q，Wang Z，Zhu P,et al.Effects of subconvulsive electrical stimulation to the hippocampus on emotionality and spatial learning and memory in rats〔J〕.Chin Med J (Engl)，2003;116(9):13615.

　　6 Nunneley SA，Martin CC，Slauson JW,et al.Changes in regional cerebral metabolism during systemic hyperthermia in humans〔J〕.J Appl Physiol，2002;92 (2)：84651.

　　7 李轶聪，李 悦，王彦松,等.不同次数和剂量异丙酚预处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤的作用〔J〕.中华麻醉学杂志，2006;26(8)：720.

　　8 Osakada F，Hashino A，Kume T,et al.Alphatocotrienol provides the most potent neuroprotection among vitamin E analogs on cultured striatal neurons〔J〕.Neuropharmacology，2004;47(6)：90415.

　　9 孙永海,岳 云,王 云.异丙酚和咪唑安定预处理对大鼠全脑缺血损伤的保护及递质机制〔J〕.中风与神经疾病杂志，2005;22(4)：3447.

　　10 Luo T，Xia Z，Ansley DM,et al.Propofol dosedependently reduces tumor necrosis factoralphainduced human umbilical vein endothelial cell apoptosis：effects on Bcl2 and Bax expression and nitric oxide generation〔J〕. Anesth Analg，2005;100(6)：16539.

　　11 Acquaviva R，Campisi A，Raciti G,et al.Propofol inhibits caspase3 in astroglial cells：role of heme oxygenase1〔J〕.Curr Neurovasc Res，2005;2(2):1418.