高血压大鼠不同时期心肌细胞及血管内皮细胞中VEGF的表达变化

　　作者：李艳 杜金凯 李汝泓 高福禄 作者单位：承德医学院附属医院麻醉科，河北 承德 067000

　　【摘要】 目的 观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)在高血压不同阶段心肌细胞和血管内皮细胞的分布变化。方法 选用遗传性盐敏感型高血压大鼠(DahlS)和遗传性盐抵抗型高血压大鼠(DahlR)，在5周龄投与8%食盐饲料，分别在10、11、12 w时取材，制作心肌组织切片。应用免疫组织化学方法观察VEGF在心肌组织中的表达变化情况，计算单位面积心肌组织VEGF的阳性细胞数和血管内皮细胞的阳性表达。结果 VEGF免疫细胞在DahlS 和DahlR组大鼠的心肌细胞及血管内皮细胞中均有表达，DahlS 组VEGF阳性细胞数均较同时期DahlR组增多(P<0.01)。DahlS组自10 w起至12 w心肌细胞VEGF阳性细胞数逐渐增多(P<0.01)。DahlR组在高血压不同时期VEGF无显著性变化。心肌组织的血管内皮细胞的表达强度，DahlS组VEGF由(+)到()，且均可见组织内毛细血管增多。DahlR组无变化。结论 VEGF在心肌细胞和心肌细胞间的血管上均有表达，并随高血压的病程延长呈上升趋势。

　　【关键词】 血管内皮细胞生长因子 免疫组织化学 高血压 心肌细胞 血管内皮细胞 Dahl大鼠

　　血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子对细胞的移行、分化、增殖等具有重要影响，参与机体的许多生理、病理过程。它们可以通过自分泌和/或旁分泌的形式作用于靶组织，促进相应组织细胞生长、发育和成熟。近几年研究认为，心肌局部产生的生长因子可能以自分泌和/或旁分泌方式介导机械应力致心肌细胞肥大效应〔1〕。本研究通过免疫组织化学方法，以Dahl高血压大鼠为研究对象，观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)在高血压不同阶段心肌细胞和血管内皮细胞的分布变化，以期为高血压性心脏病的研究提供理论基础和新治疗途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象

　　从日本成和实验动物研究所引进4周龄雄性盐敏型大鼠(DahlS)和盐抵抗大鼠(DahlR)投予8%食盐饲料，采用尾筒法(tail cuff)每周测一次收缩期血压，并记录。

　　1.2 材料

　　一抗VEGF、SP试剂盒、封闭用正常羊血清、DAB显色剂等购于北京中山生物技术有限公司。

　　1.3 方法

　　将DahlS和DahlR组大鼠分别在鼠龄10、11、12 w时随机各抽取6只，麻醉后迅速开胸，由左心室入主动脉插管，剪开心耳，依次灌注0.9%生理盐水250 ml、4%多聚甲醛液、磷酸缓冲液300 ml，维持30 min，取心脏，4%多聚甲醛液固定，取左心室心肌组织，石蜡包埋。德国AO切片机连续切片，片厚6 μm，裱于APES载片上。

　　1.4 免疫组化染色

　　每只大鼠选切片5张，进行VEGF免疫组化染色，苏木精复染，盐酸酒精分色;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。阴性对照切片与其相应的实验切片裱在同一张载片上，以PBS代替一抗。每批染色均设空白对照。每例取8张切片，每张切片在Olympus双目显微镜下观测，随机取10个阳性细胞分布均匀的区域，计数单位面积(0.169 mm2)的阳性表达。

　　1.5 免疫组化半定量标准

　　阴性(-)：胞浆内无淡黄色及棕黄色颗粒或阳性颗粒在10%以下;弱阳性(+)：胞浆呈浅黄色及棕黄色颗粒在10%～30%;阳性()：胞浆呈桔黄色，反应颗粒增多30%～70%;强阳性()：胞浆呈棕黄色，充满反应颗粒70%以上。主要观察指标：VEGF在心肌细胞和血管上的表达情况，bFGF在心肌细胞和血管上的表达情况。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS/PC+统计软件。将数据输入微机，行析因方差分析。

　　2 结 果

　　VEGF在心肌细胞和血管上的表达：DahlS和DahlR大鼠的心肌组织可见VEGF阳性的心肌细胞和血管内皮细胞。阳性表达的心肌细胞及血管平滑肌细胞胞质内可见较为明显的棕黄色颗粒。DahlS组VEGF阳性的心肌细胞从数量上明显多于同时期的DahlR组(F交互=208.09,P<0.01)。10 w时DahlS阳性细胞数平均单位面积为20.42，DahlR阳性表达细胞数平均单位面积为9.35;11 w时DahlS阳性细胞数平均单位面积为30.05，DahlR阳性表达细胞数平均单位面积为9.27;12 w时DahlS阳性细胞数平均单位面积为40.33，DahlR阳性表达细胞数平均单位面积为9.33。表明周龄相同时，阳性细胞表达DahlS明显高于DahlR组(P<0.01)。DahlS组不同周龄间差别有统计学意义，表现为随周龄增大而增强;DahlR组不同周龄间无差别。DahlS组随高血压进展，血管内皮细胞胞浆阳性颗粒着色程度加深(+～);DahlR组无明显变化。同一时期内DahlS组较DahlR组血管内皮细胞着色加深。

　　3 讨 论

　　VEGF是分子量为34～46 kD的碱性蛋白质，为心源性活性肽，存在于正常心肌细胞和血管内皮细胞，特异地刺激血管内皮细胞增殖〔2〕。VEGF发挥作用主要是通过两种高亲和力的酪氨酸蛋白激酶受体，其中一种受体KDR分布广泛，目前研究显示，它在包括心肌血管内皮细胞在内的所有内皮细胞表达。VEGF发挥生物学作用主要是与细胞上的受体结合，并特异地作用于血管内皮细胞，导致细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化，调节细胞生长，刺激细胞增殖，从而引起细胞肥大。在缺氧条件下培养心肌细胞，VEGF基因表达增强〔3〕，而压力负荷所致的肥大心脏，心内膜血流量减少，存在心肌局部缺氧现象〔4〕。高血压早期，血流动力学的改变和心肌局部缺血缺氧是刺激VEGF表达增加的主要原因。高血压心肌肥大时，心肌明显缺血缺氧，这可能是心肌VEGF及其基因表达明显增强的原因之一，也可能与心肌蛋白激酶C和蛋白激酶A激活有关。本实验结果说明高血压可以增加VEGF在心肌细胞的表达量，也说明VEGF可能参与了心肌细胞的肥大反应。至于它是促进作用还是抑制作用尚须进一步研究。李夏等报道，自发性高血压大鼠心肌VEGFmRNA表达明显强于对照大鼠〔5〕。最近研究也发现肺动脉狭窄引起的右心肥大心脏的心肌细胞VEGF基因表达增强〔6〕，这些实验结果为我们的实验研究提供了有力的佐证。由此我们可以推测VEGF可能参与心肌肥大机制。

　　VEGF、bFGF、TGFβ等多种生长因子和细胞因子具有促进血管生成的作用，在众多的血管生成因子中，VEGF作用最强，其他因子的血管生成作用是全部或部分通过增强VEGF的表达及生成作用实现的〔7〕。越来越多的证据表明〔8，9〕，生长因子可以在心脏内表达，并在心肌肥厚和/或重构中起非常重要的作用，有些生长因子高分泌可以刺激VEGF表达增加，从而促进毛细血管增生。心肌肥大是一个复杂的病理变化过程，多种生长因子参与该过程，同时生长因子之间也存在着相互作用。在生理状态下，VEGF阳性细胞在心肌细胞和血管内皮细胞也有表达，通过对VEGF在Dahl高血压大鼠不同时期心肌细胞及血管内皮细胞表达变化的研究，进一步证实了VEGF在高血压心肌细胞肥大中的作用，生长因子在高血压心肌肥大的发生发展中是互相促进、协同作用的。通过对本实验的研究，为高血压心肌细胞肥大的发生机理提供了理论依据和新的研究方向。本实验应用免疫细胞化学方法证实：随着高血压病程的延长，程度的加重，VEGF心肌细胞和血管内皮细胞的表达发生显著变化。VEGF随着高血压的发展在心肌细胞的表达数量逐渐增多，在血管内皮细胞的阳性表达也逐渐增强，并且心肌细胞间毛细血管增多。

　　【参考文献】

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