肝缺血/再灌注损伤与高胆红素血症关系的研究

　　作者：吴秀玲, 王红梅, 卞文安, 孙湛, 马小娟 作者单位：新疆石河子市人民医院麻醉科, 新疆石河子832000

　　【摘要】 目的：探讨大鼠肝缺血/再灌注(I/R)损伤致高胆红素血症发生的可能机制。方法：健康Wistar大鼠48只随机分为对照组、缺血30 min组(I组)、缺血30 min即刻再灌注组(I/R组)及I/R 1、2、4 h组共6组，每组8只，测定各组肝组织肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素6(IL6)的含量及髓过氧化物酶(MPO)、黄嘌呤氧化酶(XO)、丙二醛(MDA)的活性和血清总胆红素(TB)、结合胆红素(CB)、非结合胆红素(UCB)、总胆汁酸(TBA)的含量，并对各组各项指标进行比较。结果：肝组织TNFα、IL6含量及MPO、XO、MDA的活性和血清TB、CB、UCB、TBA的含量随着I/R时间的延长而有逐渐升高和增强的趋势。与对照组、I组相比，I/R及I/R1、2、4 h组各指标均明显升高和增强，差异有统计学意义(P<0.05);I/R1、2、4 h组亦明显高于I/R组(P<0.05)。经相关性分析，TNFα与IL6、MPO、XO、MDA，MDA与TB、 CB、 UCB、 TBA呈正相关。结论：肝I/R损伤可引起肝细胞XO活化，中性粒细胞浸润，释放的氧自由基及产生的TNFα和IL6可能参与了肝细胞损伤的发生机制，并导致高胆红素血症的发生。

　　【关键词】 肝脏; 缺血/再灌注损伤; 高胆红素血症

　　Relationship between liver ischemia/reperfusion injury and hyperbilirubinemia

　　WU Xiuling, WANG Hongmei, BIAN Wenan, et al

　　(Department of Anesthesiology, Shihezi People′s Hospital, Shihezi 832000, China)

　　Abstract： Objective： To investigate the possible mechanisms of hyperbilirubinemia resulted from the liver ischemia/reperfusion(I/R)injury. Methods：Fortyeight healthy Wistar rats were randomly divided into six groups including the control, ischemia and four I/R (I/R, I/R1h, I/R2h and I/R4h) group. Each group contained eight rats. The contents in the liver tissue were respectively determined of tumor necrosis factor alpha (TNFα), interleukin6 (IL6), myeloperoxidase (MPO), xanthine oxidase (XO), malondialdehyde (MDA), serum total bilirubin (TB), conjugated bilirubin (CB), unconjugated bilirubin (UCB) and total bile acid (TBA) in each group. Comparisons were performed among the groups. Results： The contents of TNFα and IL6, the activity of MPO, XO increased gradually with the time extension of liver I/R. Compared with control and ischemia group, the contents in I/R, I/R1, I/R2 and I/R4h groups were significantly higher (P<0.05). The I/R1h, I/R2h and I/R4h group were higher than the I/R (P<0.05). The positive correlation existed in TNFα with IL6, MPO, XO and MDA; MDA with TB, CB, UCB and TBA. Conclusion： Liver I/R injury could cause activation of XO in hepatic cell, infiltration of neutrophilic granulocyte, delivery of oxygen free radical and production of TNFα and IL6, which contributed to the mechanisms of hepatic cell injury and hyperbilirubinemia or hepaticogenic hyperbilirubinemia.

　　Key words： liver; ischemia/reperfusion injury; hyperbilirubinemia

　　引起肝缺血/再灌注(I/R)损伤的机制较复杂，近年来认为肝I/R损伤是一个全身炎症反应过程，而高胆红素血症是肝移植术后常见的并发症，原因和机理错综复杂，高胆红素血症的防治关系着手术的成败及预后[1]。本实验观察大鼠I/R过程中肝脏分泌和排泄功能的变化与肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)、髓过氧化物酶(MPO)、黄嘌呤氧化酶(XO)、丙二醛(MDA)的关系，以探讨肝I/R损伤导致高胆红素血症发生的可能机制，为临床诊断、治疗提供理论和实验依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物及分组健康Wistar大鼠48只，体重200~250 g，由新疆医科大学动物实验室提供。48只随机分成对照组、缺血30 min组(Ⅰ组)、缺血30 min即刻再灌注组(I/R组)及缺血30 min再灌注1、2、4 h组(I/R1、2、4 h组)，每组8只。

　　1.2大鼠I/R模型的建立实验前12 h大鼠禁食，乙醚浅麻醉。清洁大鼠，取上腹部正中切口进入腹腔，暴露肝门部，除对照组外，其它各组大鼠均用无创血管钳夹于肝门部，阻断肝动脉和门静脉，造成100%实质性肝缺血，持续30 min后去除血管钳，形成再灌注。按分组要求的时点分别留取左心室血液，随后立即处死动物取材。手术过程中均需无菌操作。

　　1.3各项指标的测定

　　(1)TNFα、IL6:采用放射免疫方法测定肝组织中TNFα、IL6的含量。TNFα试剂盒购于北京原子高科核技术应用股份有限公司;IL6试剂盒购于北京北方生物技术研究所。(2)MPO、XO和MDA:按试剂盒要求进行操作，试剂盒购于南京生物建成有限公司。(3)血清总胆红素(TB)、结合胆红素(CB)、非结合胆红素(UCB)和胆汁酸(TBA):左心室取血，分离血浆，-70℃冰箱放置，采用美国产BECKMAN CX7型全自动生化仪进行测定。

　　1.4统计学处理

　　采用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理。实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析和两两比较的q检验;指标间相关性分析应用简单相关分析，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1各组肝组织中TNFα、IL6含量及MPO、XO和MDA活性的变化随着I/R时间的延长，肝组织中TNFα、IL6含量及MPO、XO、MDA的活性有升高和增强的趋势;与对照组、I组相比，I/R及I/R 1、2、4 h组各指标均明显升高和增强(P<0.05~0.01),I/R 1、2、4 h组亦明显高于I/R组(P<0.05~0.01)(表1)。表1各组肝组织TNFα、IL6的含量及MPO、XO、MDA活性的变化(略)注：与对照组相比,△P<0.05, △△P<0.01;与I组相比, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01;与I/R组相比, *P<0.05 , **P<0.01;与I/R1 h组比较, #P<0.05

　　2.2各组血清TB、CB、VCB、TBA含量的变化随着I/R时间的延长，血清TB、CB、UCB、TBA的含量逐渐增加。与对照组、I组、I/R组比较,I/R 1、2、4 h组均明显增加(P<0.01);I/R4 h组亦明显高于I/R 1、2 h组(P<0.05)(表2)。表2各组血清TB、CB、UCB、TBA含量的变化(略)注：与对照组相比, △P<0.01;与I组相比, ▲P<0.01;与I/R组相比, *P<0.01;与I/R1 h组比较, #P<0.01;与I/R2 h组比较, ※P<0.05

　　2.3相关性分析TNFα与MPO、MDA、XO呈正相关(r分别为0.294、0.561、0.369),IL6与MPO、MDA、XO呈正相关(r分别为0.528、0.505、0.514),MPO与MDA、XO呈正相关(r分别为0.396、0.452),XO与MDA呈正相关(r=0.468),MDA与TB、CB、UCB、TBA呈正相关(r分别为0.769、0.768、0.752、0.706)。

　　2.4肝脏HE染色观察正常肝组织中无中性粒细胞浸润，肝细胞排列整齐，肝界板完整，肝血窦清晰可见。I/R4 h组炎性细胞在肝组织中聚集成团,大量散在分布，肝细胞肿胀明显,呈气球样变，有局灶性坏死区，肝血窦受压明显或不存在，肝界板破坏，肝脏结构紊乱(图1、2)。

　　3讨论

　　肝I/R是决定肝移植成败的关键因素，而高胆红素血症是肝移植术后常见的并发症，正常时胆红素的生成、运输和肝对胆红素的摄取、运载、结合、排泄以及肝外的胆红素排泄之间保持着动态平衡,如果其中一个或数个环节发生障碍，就会导致高胆红素血症的发生[2]，本实验探讨肝I/R损伤时高胆红素血症的发生机制。 TNFα、IL6是肝I/R损伤的重要介质[3，4]。TNFα在组织I/R损伤中有多重功能，急性期直接引起组织损伤[5]，之后刺激细胞反应，通过上调粘附因子或组织因子(TF)的表达进一步加重组织的损伤[6，7]。而IL6在组织I/R损伤中可激活枯否细胞(KC)分泌更多的细胞因子，通过细胞因子的网络，引起炎症瀑布式放大效应，从而引发对肝的损伤作用[8]。本实验结果表明，在肝I/R损伤过程中，肝组织中TNFα、IL6的含量随着再灌注时间的延长逐渐升高，肝脏I/R1h组升高明显，说明肝脏缺血以及缺血后血流的再通等因素都可使单核巨噬细胞被激活，释放出TNFα、IL6等多种炎性因子，加重肝组织的损伤[9]。炎症反应与I/R损伤关系密切。研究表明，肝I/R损伤是一个由肝脏KC激发并经中性粒细胞(PMN)介导的进一步扩大的损伤[10]。MPO是PMN嗜天青颗粒中含量较高的溶酶体酶，既能间接反映肝脏浸润中性粒细胞的数量,又能反映其激活程度。本实验结果发现，I/R及I/R1、2、4 h组肝组织中MPO的活性均明显高于对照组，说明在肝I/R过程中，随着再灌注时间的延长，肝组织中有大量的PMN浸润，进一步加重了肝组织损伤。XO主要存在于毛细血管内皮细胞内，属需氧脱氢酶类，是体内核酸代谢中的重要酶。本实验结果发现，在肝I/R过程中，I/R及I/R1、2、4 h组肝组织中XO的活性均明显高于对照组，说明XO活化产生的氧自由基，导致肝细胞进一步损伤。而MDA是自由基连锁反应的产物，I/R组与对照组比较肝组织中MDA明显升高，在肝I/R2h组升高更明显，说明氧化性损伤使体内脂质过氧化反应强烈，促进肝I/R损伤。相关性分析发现，TNFα、IL6、MPO、XO、MDA各项指标间呈正相关，说明肝I/R产生的炎性细胞因子TNFα、IL6可介导肝细胞的损伤，中性粒细胞浸润于肝组织并通过呼吸爆发产生大量氧自由基，同时XO的迅速活化也产生大量氧自由基，通过对细胞膜脂质过氧化反应产生MDA等脂质过氧化物，导致肝细胞损伤。血清TB由CB和UCB组成，TB、CB、UCB、TBA是反映肝脏分泌状态、肝脏合成与代谢、肝细胞损伤的血清学指标，其含量的变化能敏感地反映肝脏功能的轻微变化，即当肝功能受损，肝细胞有分泌或摄取障碍时，血清TB、CB、UCB、TBA含量随之相应升高[11]。本实验结果显示，在肝I/R损伤过程中，随着再灌注时间的延长，TB、CB、UCB、TBA含量升高明显，MDA与TB、CB、UCB、TBA呈正相关，表明肝I/R损伤过程中，氧自由基通过对细胞膜脂质过氧化反应造成肝细胞的损伤，引起肝脏分泌和排泄功能发生障碍。综上所述，肝I/R损伤可引起肝细胞XO活化，中性粒细胞浸润，释放的氧自由基及产生的TNFα、IL6可能参与了肝细胞损伤的发生机制，肝脏分泌和排泄功能受到障碍，并导致高胆红素血症的发生，即肝源性高胆红素血症。

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