顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量的探索
发表时间：2010-06-25 浏览次数：485次
作者：李周儒，于常州，蔡红星 作者单位：1.徐州医学院法医学教研室，江苏徐州221002;2.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室
【摘要】 目的 建立检测血液中乙醇含量简便、准确的方法。方法 以叔丁醇作为内标，用顶空气相色谱火焰离子化检测器对样品进行检测，与平行操作的乙醇标准品比较，用内标法以乙醇对内标物的峰面积比进行定量。结果 色谱图上目标峰与内标峰分离完全，在0.01～10.0 g/L范围内标准工作曲线线性关系良好。结论 顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量快速灵敏，能准确定量。该方法可用于实际检测分析。
【关键词】 气相色谱 顶空法 血液 乙醇 含量测定
血液中乙醇浓度的高低,是判定一个人清醒程度的重要指标。目前国内大多采用国标法测定,即重铬酸钾氧化硫酸亚铁铵滴定法。该法花费时间长,条件不易控制。由于血液中含有各种蛋白质和胶状物质，比较黏稠,因此不能采用直接气相色谱法测定。本实验采用顶空气相色谱法，通过对待检血样进行适当处理和色谱条件的摸索，从而对实验方法有所改进。
1 材料和方法
1.1 主要仪器 TP2100气相色谱仪，配有火焰离子化检测器和色谱数据工作站。
1.2 试剂 空白抗凝血，无水乙醇(分析纯)，叔丁醇(分析纯，内标物)。
1.3 试剂配置
1.3.1 乙醇标准储备液、叔丁醇标准储备液 用移液器分别准确吸取无水乙醇1.26 ml(相对密度0.7893)、叔丁醇1.24 ml(相对密度0.803 7)于100 ml容量瓶中,用重蒸水稀释至刻度,混匀，分别得浓度为10 g/L的乙醇标准储备液、叔丁醇标准储备液。置4℃冰箱保存(可保存1年)。
1.3.2 乙醇标准工作液、叔丁醇标准工作液 分别吸取一定量的乙醇标准储备液和叔丁醇标准储备液，用重蒸水稀释10倍，分别得浓度为1 g/L的乙醇标准工作液和叔丁醇标准工作液。
1.4 色谱条件 色谱柱Hayes EPQ 2 M×2 mm，柱温120℃，检测室温度250℃，气化室温度250℃，载气(N2)流速0.020～0.035 L/min，燃气和空气流速根据仪器条件选定。
1.5 样品制备 精确吸取2份待测全血0.5 ml，分别加入样品瓶中,加100 μl(1 g/L)叔丁醇标准工作液作为内标，用密封钳加封铝帽，密封好瓶塞,混匀，置60℃恒温水浴箱内，水浴15 min。
另取空白全血2份，根据待测血液中乙醇含量的多少(目测乙醇峰面积的大小)，添加相应的乙醇标准工作液(20 μg～2 mg)，内标液按上述方法平行操作，作为已知对照。
1.6 样品检测 用2 ml注射器分别吸取检材、已知对照瓶内液面上的气体约1.5 ml，注入气相色谱仪中，每个试样进样2次;并注入乙醇标准工作液。
1.7 标准曲线的制作 将10 g/L的乙醇标准储备液用重蒸水分别稀释10、100、1000倍，得浓度分别为1、0.1、0.01 g/L的乙醇标准液，然后分别取0.05、0.1、0.2、0.4 ml的1 g/L乙醇标准液，0.1、0.2 ml的0.1 g/L乙醇标准液，0.1、0.2 ml的0.01 g/L乙醇标准液，同时加入0.2 ml的1 g/L叔丁醇标准工作液做内标，检测后制作标准工作曲线。见表1。
1.8 记录与计算 记录检材及已知对照中乙醇及内标峰面积值，填入GC定量分析记录表中，并计算出各检材中乙醇及内标的平均峰面积。表1 标准工作曲线相关数据 乙醇添加量理论计算的乙醇浓度根据表1的数据，计算标准曲线的回归方程及相关系数：
y=1.4062x+0.0268，r=0.993
计算检材中醇含量W(g/100 ml)
W=f×检材中的醇峰面积平均值×内标添加量(μg)×100检材中内标峰面积平均值×检材量×1000
f=空白检材中醇添加量×内标峰面积平均值空白检材中内标添加量×醇峰面积平均值
计算相对相差(用来检验平行操作的稳定性及数据的可靠性)：
相对相差(%)=|W1-W2|W×100
式中W1、W2为2份检材平行定量测定的结果，W为2份检材平均值。
2 结 果
2.1 测定的色谱图 见图1、2。
该条件下目标峰与内标分离完全，(3.39±0.5)min处为乙醇目标峰，(10.0±0.5)min处为内标峰。
2.2 线性关系 在确定的最佳试验条件下,对不同浓度的乙醇标准工作液进行测定,其回归方程为y=1.4062x+0.0268,r=0.993。在乙醇浓度为0.01～10.0 g/L范围内，血液中乙醇含量与相应的峰面积值呈良好的线性关系，测定限为0.01 g/L。
图1 已知对照色谱图
图2 待测样品色谱图
3 讨 论
应用顶空气相色谱法测定血液中乙醇浓度不失为一种快速有效的方法，但也受到一些条件限制。①恒温水浴箱的温度对检测结果的影响：在不同的温度下测定样品的峰面积,其峰面积随着温度的升高而增高,但是温度不能超过水的沸点100℃,温度过高会给精密度带来不利影响,因此将温度选在60℃。被测组分浓度在测定限附近时,温度选在60℃[1]。②汽化瓶内样品平衡时间的影响：将炉温定于60℃,在不同的平衡时间内分别测定。为保证体系充分平衡,本法选定平衡时间为12 min。
通过对温度、时间等条件进行控制，在限定温度条件下,高沸点的组分不进柱,对色谱柱的污染少,从而延长色谱柱的使用寿命[2]。
利用本法可以进行自动分析,从而节省分析时间,故适用于成批量样品的测定。本法操作简单,条件易于掌握,线性范围宽,准确度和精密度高。
【参考文献】
[1] GB/T5009-1996，食品卫生检验方法(理化部分)[S].
[2] GB12288-90，水果、蔬菜制品乙醇含量的测定[S].
