葛根素通过PI3K/Akt途径对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制

　　作者：马亚飞 刘新伟 乔 欣 王群英 杨海燕 作者单位：(重庆医科大学附属第一医院麻醉科，重庆 400016)

　　【摘要】 目的 观察葛根素预处理对缺血再灌注(I/R)大鼠心肌细胞凋亡的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系。方法 30只SD大鼠随机分为假手术组(SH组)、缺血再灌注组(I/R组)、葛根素预处理组(PU组)、葛根素预处理+LY294002组(PU+ LY组)及缺血再灌注+LY294002组(I/R+ LY组)。除假手术组外，其他各组大鼠均行结扎冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min，监测血流动力学，Western印迹法检测心肌组织pAkt信号蛋白的表达;TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果 与I/R组比较，PU组能够明显改善心功能，抑制心肌细胞凋亡，并增加Akt的磷酸化水平(P<0.05，P<0.01)。结论 葛根素预处理能够抑制缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡，其作用机制与PI3K/Akt信号通路活化有关。

　　【关键词】 葛根素;缺血再灌注;磷脂酰肌醇3激酶;丝(苏)氨酸激酶

　　The antiapoptotic effect of puerarin on myocardial ischemiareperfusion injury mediated by PI3K/Akt signaling pathway in rats

　　MA YaFei，LIU XinWei，QIAO Xin，et al.

　　Department of Anaesthesiology，the First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the signaling pathway involved in the inhibition of apoptotic effect during myocardium ischemia reperfusion with Puerarin preconditioning.Methods 30 male SD rats were divided randomly into five groups (n=6).The myocardial injury of rats ware produced by the ligation of left coronary artery for 30 min followed by 120 min reperfusion.LVSP and±dp/dtmax were recorded at before ischemia, ischemia 30 min and reperfusion 120 min. The pAkt signaling protein expression was determined by Western blotting analysis. Cardiac myocyte apoptosis was determined by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) methods. Results In puerarin preconditioning group, the systolic and diastolic function were improved; the apoptosis index was significantly attenuated; the expression of pAkt was increased as compared with those of IR group (P<0.05, P<0.01). The systolic and diastolic function were significantly reduced; the apoptosis index was increased; the expression of pAkt was lowered in PU+LY group as compared with those of PU group (P<0.05, P<0.01). There was no significant difference among the parameters of PU+LY, I/R+LY, and I/R groups. Conclusions Preconditioning with puerarin can inhibit the ischemiareperfusioninduced cardiomyocyte apoptosis, the mechanism of which is partly via the PI3K/Akt signaling pathway activation.

　　【Key words】 Puerarin;Ischemiareperfusion;PI3K; AKT

　　研究表明，葛根素可增强心肌抗氧化能力、抑制心肌脂质过氧化，抑制钙超载，促进线粒体 ATP 敏感性钾通道(mitoKATP)的开放，抑制线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放等多种抗心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用〔1～3〕，但其机制尚未阐明。由于心肌I/R过程中心肌损伤的发生是多因素多途径的，所以阻断心肌损伤级联反应中关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治心肌损伤和细胞凋亡的最有效方法。磷酸肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K /Akt)信号通路是细胞内重要的信号转导通路，在对抗心肌缺血再灌注损伤、抑制细胞凋亡中发挥重要作用〔4〕。因此，本研究通过复制大鼠心肌I/R损伤模型，探讨葛根素预处理对I/R心肌细胞凋亡的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及试剂 健康雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。葛根素注射液(浙江康恩贝制药股份有限公司，40 mg/ml)、PI3K/Akt 信号通路抑制剂 LY294002(Cell signaling 公司);pAkt(Ser473) 抗体(碧云天);TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2 I/R模型制备 健康雄性 SD 大鼠以 10% 水合氯醛 3～4 ml/kg 作腹腔注射麻醉，将针形电极插入四肢皮下。分离左颈静脉置管用于注药，分离左颈总动脉插入一含 0.1% 肝素生理盐水的导管至左心室，通过 BL410 生物机能实验系统记录心电图和左心室血流动力学变化。气管插管接人工呼吸机作机械通气，沿胸骨左缘第 2～4 肋间隙开胸，自制拉钩拉开肋骨，在左心耳及肺动脉圆锥间找到冠状动脉左前降支(LAD)，在距其起始部 3～4 mm 处用 40 带线缝合针穿过，将一小段聚乙烯管(直径 1.5 mm)置于结扎线下，收紧结扎线以阻断 LAD 血流，阻断 30 min 后，松线再灌注 120 min。以结扎 LAD 后心电图Ⅱ导联 ST 段出现弓背向上抬高，T 波高耸等为缺血成功，放松结扎线后，抬高的 ST 段下降 1/2 以上为再灌注成功。

　　1.3 实验分组 雄性 SD 大鼠 30 只随机分成 5 组，每组 6 只。①假手术组(SH 组)：开胸,在 LAD 下穿线但不结扎，在穿线前 15 min 经左颈静脉缓慢注射生理盐水(2.5 ml/kg)，连续观察 150 min。②缺血再灌注组(I/R 组)：在结扎前 15 min经左颈静脉缓慢注射生理盐水(2.5 ml/kg)， 缺血 30 min，再灌注 120 min。③葛根素预处理组(PU 组)：缺血前 15 min 经左颈静脉缓慢注射葛根素(2.5 ml/kg)，余同 I/R 组。④葛根素 + LY29400组(PU+LY 组)：给葛根素前 15 min 经左颈静脉缓慢注射 LY29400 (0.3 mg/kg)〔5〕，余同 PU 组。⑤I/R + LY294002 组(I/R+LY 组)：缺血前 15 min 经左颈静脉缓慢注射 LY29400 (0.3 mg/kg)，余同 I/R 组。

　　1.4 心功能测定 经 BL410 生物机能实验系统观察缺血前、缺血30 min、再灌120 min 时左心室收缩压(LVSP)、左室内压变化最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

　　1.5 Western印迹检测心肌组织信号蛋白的表达 心肌组织用液氮研磨至粉末,加蛋白裂解液裂解30 min后，4℃ 15 000 r/min离心 15 min,取上清，进行Bradford比色法测定蛋白质浓度检测蛋白浓度后分装,于 -80℃冰箱保存备用。20 μg蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，电转膜至 PVDF 膜，5% 的脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗PAKT (1∶500) 4 ℃ 过夜,二抗室温 1 h，并以兔抗鼠 βactin (1∶500) 单克隆抗体同上操作，作为上样对照，化学发光试剂显影,暗室曝光冲片,利用 BioRad 图像分析系统进行条带的分析，将各组 pAKT 密度值分别与 βactin 密度值的比值作为相对表达量，进行统计分析。

　　1.6 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 再灌注结束后迅速分离心脏,去除心房和右心室，PBS 液冲洗干净，中性甲醛液 4 ℃ 固定 24 h 后制备石蜡切片。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。随机选取 5 个高倍视野(400 倍)，光镜下分别计数凋亡细胞数和总细胞数,以凋亡细胞数占细胞总数的百分比作为凋亡指数(AI)，AI = 凋亡细胞数/心肌细胞总数×100，评价凋亡程度。

　　1.7 统计学处理 采用 SPSS 13.0 统计软件，计量资料以x±s表示，血流动力学采用重复测定的方差分析，其余指标采用单因素方差分析，两两比较采用 SNKq检验。

　　2 结 果

　　2.1 葛根素预处理对I/R大鼠血流动力学的影响 各组大鼠冠脉结扎前LVSP和±dp/dtmax 的基础值组间无明显差异。I/R 组、PU组、PU+LY 组、I/R+LY 组在缺血30 min 和再灌 120 min时 LVSP和±dp/dtmax的绝对值呈进行性下降，与SH组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与 I/R组比较，PU 组明显减轻各时间点 LVSP和±dp/dtmax 绝对值的降低(P<0.05)。与 PU 组比较，PU+LY组和I/R+LY组各时间点的 LVSP和±dp/dtmax 的绝对值明显降低(P<0.05)，见表 1。表1 各组大鼠不同时间点 LVSP 和±dp/dtmax的比较(x±s，n=6)与I/R组比较：1)P<0.05;与SH组比较：2)P<0.05;与PU组比较：3)P<0.05

　　2.2 葛根素预处理对pAKT蛋白表达的影响 与SH组比较，I/R 组和 PU 组pAKT蛋白表达增加(P<0.01);与I/R组比较，PU组pAKT 蛋白表达明显增加(P<0.01);与PU组比较，PU+LY组和I/R+LY组pAKT蛋白表达水平降低(P<0.01)，见图1，表2。

　　2.3 葛根素预处理对心肌细胞凋亡的影响 与SH组比较，其余各组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.01);与I/R组比较，PU组心肌细胞凋亡降低(P<0.01)，PU+LY组和I/R+LY组细胞凋亡差异无统计学意义;与PU组比较，PU+LY组和I/R+LY组心肌细胞凋亡增加(P<0.01)，见表2。

　　图1 各组心肌组织pAKT的Western印迹结果表2 各组大鼠pAKT蛋白相对表达水平和

　　凋亡指数的比较(x±s，n=6)

　　组别pAKTAI (%)SH 组0.22±0.131.53±0.39I/R 组0.63±0.222)18.98±2.762)PU 组1.56±0.351)2)11.03±2.471)2)PU+LY 组0.45±0.153)17.79±3.152)3)I/R+LY 组0.28±0.121)3)19.47±2.552)3)

　　与 I/R 组比较：1)P<0.01;与 SH组比较：2)P<0.01;与PU组比较：3)P<0.01

　　3 讨 论

　　细胞凋亡是I/R导致心肌损伤、心肌细胞丢失的重要病理机制之一〔6〕。I/R过程中坏死和凋亡同时存在二者共同决定心肌细胞的丢失程度，直接影响心肌梗死的面积，对心梗后心功能的恢复有直接的影响。如何有效抑制细胞凋亡的发生和发展是促进缺血再灌注后心功能恢复和减轻心肌致死性损伤的一条重要途径〔7〕。葛根素在临床上广泛使用，其对心肌缺血再灌注损伤有明显保护作用研究表明，葛根素预处理可以上调Bc12蛋白表达、下调Bax蛋白表达明显减少细胞凋亡程度〔8〕;而在给予mitoKATP特异性阻断剂5HD后葛根素减轻细胞凋亡的保护效应明显减弱,提示mitoKATP通道的开放可能在葛根素抑制细胞凋亡的保护机制中发挥了重要作用〔3〕。本研究结果表明葛根素预处理能改善缺血再灌注心肌的功能，减轻心肌损伤和凋亡,与上述文献报道一致。

　　本研究结果提示PI3K/Akt信号通路的开放可能在葛根素的心肌保护机制中发挥重要作用。PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路，与细胞生命活动密切相关，参与细胞激活、蛋白合成、葡萄糖转运及血管生成等重要生理功能的调控，并介导众多外界刺激信号诱导细胞生长、分化、存活、凋亡及恶变等过程，在对抗心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用〔4〕。Akt的磷酸化是PI3K/Akt信号通路活化，发挥抗凋亡作用的关键〔9〕。该通路的活化，通过Akt可直接磷酸化前凋亡基因BAD和BAX,激活抗凋亡蛋白Bcl2;防止线粒体释放凋亡因子;或促进mitoKATP的开放，或作用肌内质网Ca2+ATP酶促进肌浆网对Ca2+的摄取，或通过作用内皮一氧化氮合酶或其产物一氧化氮(NO)，进而抑制MPTP开放等多种抗心肌细胞凋亡机制的活化，减少细胞凋亡〔10，11〕。而当应用特异性PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002和wortmannin时，上述保护作用被明显抑制。因此，葛根素的心肌保护作用可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞存活和抑制细胞凋亡。

　　综上所述，葛根素预处理对心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡具有抑制效应，而这种保护效应能被LY294002阻断，故葛根素预处理抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的保护效应可能与激活PI3K/Akt信号途径有关，而Akt激活后是具体通过何种信号途径和机制发挥抑制细胞凋亡的保护效应，还需进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 孙 鹏,刘金龙.葛根素对组织缺血再灌注损伤保护机制的研究进展〔J〕.现代中西医结合杂志，2006;15(3)：4057.

　　2 杨 波,高 琴,姚 慧,等.葛根素抗心肌细胞过氧化氢损伤的线粒体相关机制〔J〕.中国应用生理学杂志，2008;24(4)：399403.

　　3 高 翔,高 全,李 涛,等.葛根素预处理保护心肌缺血再灌注损伤的机制〔J〕.贵阳医学院学报，2007;32(1)：3741.

　　4 Hausenloy DJ，Yellon DM.New directions for protecting the heart against ischemiareperfusion injury：targeting the reperfusion injury salvage kinase(RISK) pathway〔J〕.Cardiovasc Res，2004;61(3)：44860.

　　5 Ravingerová T，Matejíková J，Neckár J，et al.Differential role of PI3K/Akt pathway in the infarct size limitation and antiarrhythmic protection in the rat heart〔J〕.Mol Cell Biochem，2007;297(12)：11120.

　　6 Eefting F，Rensing B，Wigman J，et al.Role of apoptosis in reperfusion injury〔J〕.Cardiovasc Res，2004;61(3)：41426.

　　7 Scarabelli TM，Gottlieb RA.Functional and clinical reperfusions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury:old and new concepts after 10 years of contributions〔J〕.Cell Death Differ，2004;11(2)：14452.

　　8 颜永进,李明春,浦大玲,等.葛根素对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究〔J〕.南通大学学报,2005;25(6)：4079.

　　9 Cantley LC.The phosphoinositide 3kinase pathway〔J〕.Science，2002;296(11)：16557.

　　10 Hausenloy DJ，Yellon DM.Reperfusion injury salvage kinase signalling：taking a Risk for cardioprotection〔J〕.Heart Fail Rev，2007;12(34)：21734.

　　11 Hausenloy DJ，Yellon DM.Cardioprotective growth factors〔J〕. Cardiovasc Res，2009;83(2)：17994.