重症肌无力患者外周血TGF-β的研究

张栩　孙兆林　丛志强　申黎青　韩仲岩

　　【摘要】　目的　探讨转化生长因子β（TGF-β）在重症肌无力（MG）免疫病理机理中的作用。方法　应用体外细胞培养和ELISA方法检测MG患者外周血单个核细胞经乙酰胆碱受体（AchR）刺激后产生TGF-β的水平。结果　MG患者外周血单个核细胞TGF-β水平高于正常对照组，且TGF-β水平与病程有关。结论　MG患者自身免疫功能异常，TGF-β参与了MG的免疫病理过程。 　　【关键词】重症肌无力　转化生长因子-β

A study on the peripheral blood transforming growth factor-β in patients with myasthenia gravis

Zhang Xu，Sun Zhaolin，Cong Zhiqiang,et al （Department of Neurology， Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003）

　　【Abstract】　Objective　To study the role of transforming growth factor-β(TGF-β) in myasthenia gravis(MG) immunopathogenesis. Methods　The levels of the peripheral blood mononuclear cells induced by acetylcholine receptor(AchR) to generate TGF-β in MG patients were measured with the external cell culture and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results　The levels of TGF-β in the peripheral blood mononuclear of MG patients were higher than the normal controls.The levels of TGF-β were associated with the duration of MG.Conclusion　The patients with MG had some disorder in their autoimmune system,TGF-β might play an important role in the immunopathological process of MG. 　　【Key words】　Myasthenia gravis　Transforming growth factor-β

　　重症肌无力(MG) 是神经肌肉接头处突触后膜上抗骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体抗体（AchRab)引起的自身免疫病 。AchRab的产生依赖于CD4+和CD8+T辅助（Th）细胞分泌的细胞因子［1］ 。转化生长因子-β（TGF-β）是一种具有免疫抑制功能的细胞因子，能下调T和B细胞免疫，拮抗具有增强免疫活性的细胞因子的功能［2］。国内外对MG免疫异常作了大量研究，但对TGF-β的研究较少。本研究探讨34例MG患者外周血单个核细胞TGF-β的分泌能力，进一步阐明MG的免疫机理，为MG的免疫学治疗提供依据。

1　对象和方法

1.1　对象 1.1.1　MG组　本组男17例，女17例，年龄10～84岁，平均41.5±10.1岁;病程1月～21年，平均5.4±4.7年;根据病史、体征、疲劳试验和新斯的明试验确诊。根据改良的Osserman法进行分型，Ⅰ型和Ⅱa型各8例，Ⅱb 型2例，Ⅲ型4例，Ⅳ型12例。 1.1.2　对照组(NC组)　系20例健康查体者，男11例，女9例，年龄22～45岁，平均37.2±8.1岁。 1.2　方法 1.2.1　特异性抗原乙酰胆碱受体（AchR）制备　加利福尼亚Torpedo（电鳗）的电器官纯化（由上海医科大学神经病学研究所神经免疫室赠送） 1.2.2　外周血单个核细胞（PBMNC）培养和细胞因子诱生　4 ml肝素抗凝血，Ficoll液分离单个核细胞，应用RPMI 1640(GIBCO 公司产品)培养液将单个核细胞层洗3次，将细胞浓度调至4×106 /ml，取0.2 ml加入40孔培养板，每孔加入0.1 ml含10%小牛血清的完全培养液，加入AchR，终浓度为10 μg/ml，特异性抗原对照组，不加AchR。37℃，5%CO2培养72小时收集上清液，-70℃保存备用。 1.2.3　TGF-β的测定　双抗体夹心ELISA法检测，试剂盒由美国Genzyme公司提供。 1.2.4　统计学处理　实验数据以均数±标准差(±s)表示,以t检验作两组间显著性比较,用方差分析作两组以上组间差异显著性比较。

2　结果

2.1　MG患者AchR特异性抗原对照性试验　见表1。MG患者AchR刺激后的PBMNC上清TGF-β水平高于无抗原刺激者（P<0.05）。

表1　MG组抗原特异性对照实验(±s)

　 例数 TGF-β(ng/L) 加AchR刺激组 34 692.3±465.1* 不加AchR组 20 375.5±222.1

　　与不加AchR组比较*P＜0.05 2.2　MG患者不同临床组别抗原特异性PBMNC上清TGF-β水平比较　见表2。MG患者PBMNC TGF-β水平同性别、年龄、Osserman分型、有无胸腺瘤及检查时是否使用糖皮质激素治疗无关（P>0.05）。MG患者病程>5年者较病程≤1年者PBMNC TGF-β水平增高(P<0.05)。

表2　MG患者性别、年龄、病程、分型等与抗原特异性 PBMNC上清TGF-β水平(±s)

　 例数 TGF-β(ng/L) 性别 　 　 　男 18 622.4±426.5

　女 16 771.2±506.9 年龄(岁) 　 　 　≤30 7 781.7±336.7 　＞30 27 688.9±405.4 病程(年) 　 　 　≤1 13 463.4±158.4 　1～5 11 699.5±530.8 　＞5 10 982.1±526.6 Osserman分型 　 　 　Ⅰ 8 813.2±407.2 　Ⅱa 8 690.1±387.4 　Ⅱb 2 462.2±177.3 　Ⅲ 4 362.5±68.6 　Ⅳ 12 761.6±615.2 胸腺瘤 　 　 　是 7 466.8±131.8 　否 27 750.8±503.2 糖皮质激素治疗 　 　 　是 29 510.5±200.8 　否 5 723.7±412.1

　　病程>5年组与≤1年组比较P＜0.05，其他均P>0.05 2.3　MG组与正常对照组AchR诱导的PBMNC上清TGF-β水平　见表3。MG组AchR诱导的PBMNC上清TGF-β水平显著高于NC组（P<0.01）。

表3　MG组与正常对照组AchR诱导的PBMNC 上清TGF-β水平(±s)

　 例数 TGF-β(ng/L) MG组 34 692.3±465.1* 正常对照组 18 393.6±287.7

　　与正常对照组比较*P＜0.05 3　讨论

　　采用体外培养外周血单个核细胞的方法,应用特异性抗原AchR或无抗原刺激,MG患者AchR诱导的PBMNC TGF-β水平增高,说明这种免疫应答是AchR特异性的。本组MG患者较健康对照组抗原特异性PBMNC TGF-β水平增高,同国外研究的报道相一致［2］。MG患者体内有AchR致敏 的T细胞,加入AchR体外培养,使其活化、增殖,分泌相应的细胞因子，这在一定程度上可模拟MG患者神经肌肉接头(NMJ)的病变。