半胱氨酸蛋白酶抑制剂对离体大鼠海马脑片CA1区 神经元低氧性损伤的影响

　　作者：张育才，曾因明，王钧 ，张林(中国医科大学第一临床医学院，辽宁 沈阳 110001; 江苏省麻醉医学研究所; 美国纽约州立大学医学中心麻醉科;青岛大学医学院附属医院麻醉科)

　　[摘要]目的 探讨半胱氨酸蛋白酶(Calpains)抑制剂PD150606对离体大鼠海马脑片CA1区神经元低氧性损伤的影响。方法 大鼠海马脑片随机分为单纯低氧组(Con组， n =6)、PD50组( n =10)、二甲亚砜(DMSO)组 ( n = 8)。Con组的海马脑片应用正常的人工脑脊液(aCSF)37 ℃孵育60 min，PD50组、DMSO组的海马脑片分别用含有50 μmol/L的PD150606、含体积分数0.003 DMSO的aCSF孵育60 min，所有脑片均低氧5 min，复氧 60 min 。应用细胞内记录技术，分别记录用药前及低氧前膜电位、缓慢除极的速率、快速除极时间及快速除极的幅度，复氧60 min神经元的膜电位、神经元对细胞内注入电流及SCHAFFER旁路刺激的反应。应用碘化丙啶(PI)染色方法，计数复氧60 min海马CA1区PI阳性神经元数。结果 PD50组、DMSO组、Con组神经元用药前的基础膜电位、低氧前膜电位、快速除极时间、缓慢除极的速率差异无显著性( P >0.05)。用药后PD50组神经元快速除极幅度显著低于DMSO组及Con组，差异有显著性( F=13.711，q=6.199、6.229，P <0.05)。PD50组的10例神经元中有8例在复氧60 min后膜电位逐渐恢复到基础值水平，并对细胞注入电流及经SCHAFFER旁路刺激产生高幅度、持续时间短的动作电位。此外，PD50组海马CA1区PI阳性神经元明显少于DMSO组和Con组，差异有显著性( F= 100.086 ，q=17.346、16.186，P <0.01)。结论 Calpains抑制剂PD150606可以显著减轻大鼠海马CA1区神经元低氧性损伤，减少低氧-复氧后神经元的死亡，促进复氧后神经元电生理功能的恢复。

　　[关键词] 半胱氨酸蛋白酶抑制剂;海马;低氧缺血，脑

　　EFFECTS OF CYSTEINE PROTEASE INHIBITOR ON HYPOXIC DAMAGE TO NEURONS IN CA1 REGION OF HIPPOCAMPUS IN RATS

　　ZHANG YU-CAI， ZENG YIN-MING， WANG JUN， et al

　　(The First Affiliated Hospital of China Medical Univer-sity， Shenyang 110001，China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of cysteine protease inhibitor PD150606 on hypoxic damage to neurons in CA1 region of hippocampus in rats. MethodsThe hippocampus slices were randomly divided into Con ( n =6)， PD150606 (PD50， n =10) and DMSO ( n =8) groups. The slices in Con group were treated with aCSF at 37 ℃ for 60 min before intracellular recording， and the slices in PD and DMSO groups were incubated with 50 μmol/L PD150606 and 0.003 DMSO for 60 min before in-tracellular recording. All slices in each group were subjected to 5 min hypoxia and followed by 60 min of re-oxygenation. At the end of electrophysiological research， the slices were stained with propidium idodide (PI) and the PI positive neurons in CA1 region was counted. ResultsPD150606 significantly delayed rapid depolarization and inhibited rapid depolarization ( P >0.05). After 60min of re-oxygenation， eight out of 10 neurons in the PD group had its functional recovery. The dead neurons in PD group were significantly less than those in Con and DMSO groups ( P <0.05). ConclusionCalpains inhibitor PD150606 could significantly inhibit the hypoxic damage to neurons and enhance the electrophysiological functional recovery of neurons in CA1 region of hippo-campus in rats.

　　[KEY WORDS]cysteine proteinase; hippocampus;hypoxia-ischemia， brain

　　半胱氨酸蛋白酶(Calpains)是广泛存在于哺乳类动物细胞浆内的半胱氨酸蛋白酶家族，依赖细胞浆内的钙离子浓度增加而激活。激活后的Calpains可以降解细胞骨架蛋白、电压及配体门控性离子通道及与信号转导有关的G蛋白及酶等[1，2]。应用形 态学及生化等指标的研究显示，Calpains抑制剂可以显著减轻神经元缺血低氧性损伤[3]。然而，该酶抑制剂能否促进缺血低氧后神经元功能的恢复还缺乏直接的证据。本实验采用大鼠离体海马脑片，运用细胞内记录技术，结合碘化丙啶(PI)染色法，计数海马CA1区死亡神经元，以期对Calpains抑制剂PD150606对神经元低氧性损伤的影响进行客观及全面的评价。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 选择SD大鼠12只，雄性，体质量280～340 g，由美国纽约州立大学医学中心提供。人工脑脊液(aCSF)，含有NaCl 126 mmol/L，KCl 3 mmol/L，KH2 PO41.4 mmol/L， NaHCO326 mmol/L， MgSO41.3 mmol/L，CaCl21.4 mmol/L，葡萄糖 4 mmol/L 。Calpains抑制剂PD150606，来源于美国Calbiochem公司;PI由Molecular Probes公司提供;二甲亚砜(DMSO)来源于Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1海马脑片的制备 将SD大鼠置于麻醉箱内，麻醉前预先吸纯氧3 min，然后用体积分数0.02异氟烷(Isoflurane)麻醉，待大鼠翻正反射消失后断头，快速取脑并将脑组织放入冰冷(4 ℃)预充氧的aCSF中，沿冠状切片制备厚度为400 μm的海马脑片，放置于尼龙网上，在以体积分数0.95 O2 +体积分数0.05 CO2 混合气体饱和的aCSF中室温下孵育2.0 h后用于实验。

　　1.2.2海马脑片的分组 将海马脑片随机分为单纯低氧对照组(Con组， n =6)、PD50组( n =10)以及DMSO组( n =8)。Con组海马脑片在细胞内膜电位稳定15 min后应用正常的脑脊液灌流60 min;PD50组、DMSO组的海马脑片在神经元膜电位稳定15 min后，分别用含50 μmol/L PD150606及体积分数0.003 DMSO的aCSF灌流60 min。所有海马脑片均应用体积分数0.95的N2 和体积分数 0.05 CO 2 混合气体饱和的aCSF低氧灌流5 min，复氧60 min。应用细胞内记录技术，分别记录用药前及低氧前膜电位、缓慢除极的速率、快速除极时间、快速除极幅度，以及复氧60 min时海马CA1区神经元对细胞内注入电流及对SCHAFFER侧支刺激的反应，将对刺激可以产生幅度高、持续时间短的动作电位作为神经元功能恢复的标志。

　　1.2.3死亡神经元的测定[4] 应用PI染色法进行海马CA1区死亡神经元计数。电生理实验结束后，将上述各组的海马脑片放入含有5 mg/L PI的aCSF中充氧孵育染色15 min，染色过程中注意将染色试剂避光，随后用氧饱和的aCSF洗涤海马脑片2次。应用Noran激光共聚焦显微镜，选择Rho-damine滤色镜(488 nm/515 nm)进行观察，首先在低倍显微镜下(4倍)确定海马CA1区的位置，然后 在高倍显微镜下(40倍)计数海马CA1区中任意4个视野中PI染色的神经元数，计算其平均值。

　　1.2.4统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，以SPSS 11.0程序包统计软件进行统计学处理，多组数据之间的比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1PD150606对海马CA1区神经元电生理特性的影响 3组神经元用药前的基础膜电位及低氧前的膜电位值之间差异均无显著性( F=0.494，P > 0.05 )。见表1。

　　2.2PD150606对低氧期间神经元膜电位的影响 PD50组神经元的快速除极时间大于DMSO组和Con组，但差异无显著性( F=1.476，P >0.05)。PD50组、DMSO组及Con组间神经元的缓慢除极速率比较无明显差异( F=1.789，P >0.05)。PD50组神经元快速除极幅度显著低于DMSO组及Con组，差异有显著意义( F=13.711，q=6.199、 6.229 ， P < 0.05)，而DMSO组与Con组之间则无明显差异( P >0.05)。PD50组10例经过PD150606孵育的神经元中，8例在复氧后膜电位逐渐恢复到基础值水平，细胞注入电流后产生高幅度、持续时间短的动作电位;经SCHAFFER通路刺激可以产生兴奋性突触后电位。见表2。

　　表1 3组神经元用药前的基础膜电位及低氧前的膜电位比较(略)

　　表2 PD150606对低氧期间神经元膜电位的影响(略)

　　2.3PD150606对海马CA1区神经元死亡的影响 PD50组海马CA1区神经元死亡数量为(78±15)个/mm;DMSO组为(180±22)个/mm，Con组为(197±20)个/mm，PD50组与DMSO组、Con组 比较，差异均有显著意义( F= 100.086 ，q= 17.346 、16.186 ，P <0.01);而DMSO组与Con组之间无明显差异( q=2.369，P >0.05)。

　　3 讨论

　　脑缺血低氧性损伤是临床上常见的一种病理生理现象。一般认为其损伤机制主要与能量代谢障碍、大量兴奋性氨基酸的释放及钙离子超载等有关。但临床研究显示，基于上述机制的许多药物及方法对缺血低氧性神经元并无明显的保护及治疗效果。因此，有学者认为，钙离子超载所介导的酶促水解反应在脑缺血低氧性损伤中可能发挥更大的作用[1]。Calpains是哺乳类动物细胞中广泛存在的一种半胱氨酸蛋白酶，有μ和m两种亚型，两种亚型的Calpains均含有钙调素样的Ca2+结合区域，但对Ca2+的敏感性不同。体外实验表明，μ-Calpain在微摩尔浓度的钙离子水平即可被激活，而m-Calpain则需要毫摩尔浓度的钙离子水平方可激活。Cal-pains确切的生理功能还不清楚，可能在由钙离子介导的细胞内信号传导过程中发挥着重要的作用[5]。但近来的研究显示，即使短暂的缺血低氧也可以显著增加Calpains的活性[6]。在正常情况下，体内存在一种Calpains的内源性抑制剂Calpastatin。低氧时激活的Caspase-1和Caspase-3可以引起Calpastatin的分解，从而消除或减弱了Calpastatin对Calpains的抑制，使Cal-pains的活性进一步增强。激活的Calpains可降解细胞的骨架蛋白成分，如微管相关蛋白(MAP)等;同时，激活后的Calpians还可以降解与细胞周期及细胞转录有关的蛋白成分，导致细胞死亡[1]。此外，激活的Caplains可以破坏神经元中溶酶体膜的完整性，导致溶酶体酶外漏，从而引起细胞死亡。PD150606是一种能够透过细胞膜的Calpains抑制剂，可以选择性地抑制Calpains的活性，对Calpains的两种亚型均有抑制作用。本研究显示， DMSO对低氧期间神经元膜电位快速除极的幅度、缓慢除极的速率及快速除极的时间均无明显的影响;但PD150606可以显著延缓神经元快速除极时间，降低快速除极的幅度，促进复氧后神经元功能的恢复。PD50组的10例神经元中，有8例神经元复氧60 min后恢复对细胞内注入电流及经SCHAF-FER旁路刺激的反应。正常情况下，PI不能透过细胞膜完整的神经元，但由于缺血低氧可以使神经元细胞膜的完整性破坏，使PI可以穿过细胞膜进入细胞核，与核内的DNA结合，发出高强度的红色荧光。本研究结果证实，PD50组海马CA1区PI阳性神经元的数量显著少于DMSO组及Con组。提示，Calpains抑制剂PD150606可以显著减轻大鼠海马CA1区神经元的低氧性损伤，促进复氧后神经元功能的恢复。

　　[参考文献]

　　[1] YAMASHIMA T. Implication of cysteine protease calpain， cathepsin and caspase in alchemic neuronal death of primates[J]. Progress in Neurobiology， 2000，62(2):273-295.

　　[2] LEE K S， FRANK S， VANDERKLISH P， et al. Inhibition of proteolysis protects hippocampal neurons from ischemia[J]. Proc Natl Acad Aci， 1991，88(16):7233-7237.

　　[3] JIANG Q， STYS P K. Calpain inhibitors confer biochemical， but not electrophysiological， protection against anoxia in rat optical nerves [J]. J Neurochem， 2000，74(5):2102-2107.

　　[4] BRANA C， BENHAM C， SUNDSTROM L， et al. A method for charactering cell death in vitro by combining propodium io-dide staining with immunohistochemistry [J]. Brain Research Protocols， 2002，10(2):109-114.

　　[5] SORIMACHI H， ISHIURA S， SUZUKI K， et al. Structure and physiological function of calpains [J]. Biochem J， 1997，328(Pt3):721-732.

　　[6] YAMASHIMA T， SAIDO TC， TAKITA M， et al. Transient brain ischemia provokes Ca2+， PIP2 and calpain response prior to delayed neuronal death in monkey [J]. Eur J Neurosci， 1996，8(9):1932-1944.