肝脏缺血再灌注损伤机制与药物预适应研究进展

    作者：杨金凤    作者单位：410006 湖南长沙，湖南省肿瘤医院麻醉科     【摘要】  肝脏缺血再灌注损伤是指休克复苏期、肝脏手术术中夹闭肝蒂或肝移植中离体供肝缺血后重新再灌注所造成的局部和全身的损伤。细胞内钙超载、氧自由基生成过多、细胞凋亡及炎性细胞因子的激活等是其主要的病理生理机制。针对损伤机制的药物预适应仍是防止肝缺血再灌注损伤的主要措施。目前研究证实有保护作用的主要有:钙离子拮抗剂、自由基清除剂、炎性细胞因子抑制剂、微循环改善药物、能量底物、中药等。

    【关键词】  再灌注损伤 肝脏 药物预适应 机制 细胞因子

    缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）损伤是指缺血器官在恢复血供之后细胞损伤更加加重的现象。Toledo等在1975年首先认识到IR损伤是肝移植过程中一重要病理损伤状态，可导致移植肝淤血、进行性血栓形成或（和）器官坏死，导致移植失败，但直到20世纪80年代中期，“再灌注损伤（reperfusion injury）”才逐渐在肝移植文献中应用。

    肝脏缺血再灌损伤（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）可分为热缺血和冷保存缺血再灌注损伤。热缺血再灌注损伤与肝叶切除、肝移植、低血容量性休克、毒性肝损害、静脉阻塞性疾病和Budd-Chiari综合征等普遍相关；冷保存再灌注损伤发生在器官移植前的冷保存过程中，其病理表现和发病机制与热HIRI相似。在肝脏热IR损伤中，通常将再灌注后2 h内称为早期，以氧化应激（oxidant stress）和释放反应性氧物质直接导致肝细胞损伤为特征，再灌注后6～48 h为损伤晚期，是中性白细胞聚集介导的炎症紊乱过程，同时也通过释放反应性氧物质损伤肝细胞，另外中性白细胞激活释放的弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、肝素酶、胶原酶和水化酶都对肝细胞有直接损害作用。

    目前，对HIRI的机制和药物保护的研究成为学者关注的焦点，本文就肝脏热缺血再灌损伤的进展做一综述。

    1  肝脏缺血再灌损伤可能的机制

    1.1  细胞内钙超载  细胞内钙超载是HIRI主要的病理生理机制［1］，造成细胞内钙超载的主要原因有:（1）Na+/Ca2+交换异常：细胞内Na+滞留导致Na+/Ca2+交换逆转，同时细胞内酸中毒使得H+/Ca2+交换减少，蛋白激酶活化促进Na+/Ca2+交换，使胞浆Ca2+浓度升高；（2）缺血使肝细胞受损，导致对Ca2+的通透性增加，Ca2+内流增加；（3）细胞膜钙通道的蛋白变性，也使Ca2+内流增加；（4）缺血导致线粒体结构和功能受损，无氧酵解成为主要的供能方式，使细胞内ATP合成减少，Ca2+泵排Ca2+能力和内质网摄Ca2+的能力降低而导致Ca2+潴留；（5）细胞内质网的Ca2+大量异常释放，造成细胞内Ca2+的重新分布。

    钙超载通过如下机制造成细胞损伤:（1）钙超载使线粒体内的Ca2+浓度升高，Ca2+不仅抑制ATP合成，而且可造成线粒体膜的损伤，影响细胞能量供应并可致使细胞内Ca2+进一步潴留［2］；（2）Ca2+可激活Ca2+依赖性蛋白酶，促使细胞内许多重要的酶降解并破坏细胞膜骨架，同时促使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶而间接参与了氧自由基的合成［3］；（3）激活Ca2+依赖性磷脂酶（主要是磷脂酶C和磷脂酶A2）从而破坏膜结构，而膜磷脂分解产生的游离脂肪酸、白三烯、溶血卵磷脂等均对细胞有毒害作用［4］。

    1.2  氧自由基生成过多  肝脏缺血期，组织含氧量减少，作为电子受体的氧不足，再灌注恢复氧供应，也提供了大量的电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多。（1）HIRI时，黄嘌呤氧化酶系统活性增强，黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶（XO），XO在催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤进而催化黄嘌呤转变为尿酸的过程中释放大量的氧自由基；（2）中性粒细胞在受到缺氧刺激激活后耗氧量显著增加，在细胞膜上NADPH氧化酶作用下释放大量氧自由基［5］，称为中性粒细胞“呼吸爆发”；（3）细胞缺血、缺氧可使ATP生成减少，钙进入线粒体增多，使线粒体功能受损，从而氧自由基生成增多；（4）细胞色素氧化酶功能失调，呼吸链功能障碍，电子传递链电子漏率增加及超氧化物歧化酶生成减少等亦可导致大量氧自由基生成［6～8］。

    氧自由基可通过如下机制造成肝细胞损伤：（1）氧自由基对细胞膜双层磷脂结构中的重要脂类进行氧化作用，生成多种脂质过氧化物，直接损伤细胞；（2）氧自由基能引起血小板、粒细胞在微血管中黏附、聚集，造成微循环障碍［9］；（3）氧自由基可直接氧化肝实质细胞核内DNA 双链结构，引起DNA 突变而造成肝脏结构和功能的损伤［10］；（4）氧自由基还可引发一系列复杂的生物活性分子的产生和反应，如吞噬细胞激活、内毒素的释放、补体激活、花生四烯酸代谢激活（生成前列腺素、血栓素）等而造成对肝细胞的损伤［11］。

    1.3  细胞凋亡  细胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程，是一种程序性的细胞死亡。细胞凋亡参与了HIRI过程：HIRI后 ATP依赖的死亡程序破坏，可启动死亡配体/受体反应，如Fas配体/Fas，导致caspase 激活级联反应，线粒体通透性增加和功能下降，诱化细胞凋亡和坏死［12］；HIRI时，细胞内钙超载，可激活钙依赖性中性蛋白酶（caplain）、蛋白水解酶、核酸内切酶，其中caplain的激活可以通过介导肿瘤坏死因子（TNF）转导通路［13］、和调控p53基因［14］而诱导细胞凋亡，而核酸内切酶则是与凋亡有直接关系的酶，死亡信号转导的最后结局是核酸内切酶的活化引起DNA的裂解。

    1.4  一氧化氮（NO）和内皮素（ET-1）与HIRI  肝脏星状细胞收缩使肝窦血流减少也是HIRI的部分机制。ET-1引起肝脏星状细胞收缩，而硝普钠可引起肝脏星状细胞舒张，提示肝脏再灌注损伤过程是由于ET和NO的不平衡所引起［15］；Whittle 等［16］认为HIRI早期血浆和肝组织中的ET-1水平增高，而NO水平降低，原因为 NO 合成所必需的L-精氨酸酶、NADPH 和O2均减少。

    Duranski等［17］在内源性一氧化氮合酶的转基因（endothelial nitric oxide synthase transgenic eNOS-TG）鼠HIRI模型中，发现血红素加氧酶（hemeoxygenase-1，HO-1）和NO上调，其对HIRI的保护部分是经soluble guanylyl cyclase（sGC）-cGMP 通路通过NO信号转导和HO-1 信号转导通路实现的。另外，动物实验中eNOS抑制剂可加重IR损伤，在内毒素（LPS）诱导的肝损伤模型中，抑制NO的合成，也能加重肝损伤，添加外源性NO可逆转损伤，再灌注过程中抗ET-1抗体或ET-1受体拮抗剂预处理可提高肝脏微循环血流，减轻组织损伤，更加证实NO和ET-1这两个作用于血管的因子在HIRI的病理生理过程中扮演着重要的角色［18］。

    1.5  细胞因子的参与  研究表明多种细胞因子参与HIRI的病理生理过程，这些细胞因子在肝内以自分泌、旁分泌或类似激素的方式发挥生物学效应。TNF-α、IL-1是目前研究最活跃的细胞因子，能诱导IL-8的合成，促进黏附分子的表达，提高中性粒细胞与内皮细胞相互作用的能力。TNF-α的直接毒性作用还可导致肝窦内皮细胞肿胀，引起微循环障碍，诱导Kupffer细胞产生过氧化物和中性粒细胞释放氧自由基。IL-1诱导Kupffer细胞产生TNF-α并与TNF-α协同作用于内皮细胞，诱导其合成凝血酶及纤维蛋白酶，从而破坏内皮细胞的细胞骨架，也可通过上调中性粒细胞产生氧自由基而造成肝细胞损伤。

    另外，IL-6能诱导肝细胞释放C反应蛋白、α-抗胰蛋白酶及纤维蛋白原等物质从而发挥其对肝脏的损伤作用，IL-2可与TNF协同改变蛋白酶与抗蛋白酶之间的平衡，引起内皮细胞基膜蛋白降解［19］。而Yoshidome等［20］研究发现IL-10能抑制TNF-α的mRNA表达及激活细胞间黏附的分子，从而减轻肝脏的缺血再灌注损伤。血小板激活因子（platelet activating factor，PAF）是来源于肝窦内皮细胞及激活的kupffer细胞的另一重要细胞因子，在肝脏缺血再灌注过程中，PAF既可激活黏附于肝窦内的中性粒细胞产生大量的氧自由基，同时也能诱导kupffer细胞释放TNF等毒性介质而间接地造成肝脏损伤［21］。

    1.6  核因子κB与HIRI  核因子kB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）首先是从淋巴细胞中发现的一种能与免疫球蛋白的κ轻链基因的κB序列特异性结合的核蛋白因子，可以通过调控许多炎性介质和细胞因子的基因转录，在机体的免疫应答、炎症反应及细胞生长等方面发挥作用。有研究认为：HIRI时 NF-κB激活，从而使iNOS、TNF-α和ICAM-1的mRNA表达增强，通过TNF-α及血管内皮细胞表达ICAM，促使白细胞黏附导致HIRI［20］。

    1.7  Kupffer细胞激活   Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）位于肝脏的窦状隙的内皮细胞内，是体内最大的固定巨噬细胞群，肝脏缺血再灌后激活的Kupffer细胞释放多种细胞因子或介质，其中包括有：（1）O2中间代谢产物如H2O2、超氧阴离子、自由基、单线态氧；（2）蛋白分解酶；（3）花生四烯酸代谢产物白三烯、前列腺素（PGs）、前列环素（PGI2）；（4）促凝血活性物质：凝血栓；（5）生长因子：纤维母细胞生长因子；（6）TNF-α等，在介导肝脏缺血再灌损伤中起重要的作用。

    Tsutsui等［22］发现，KC产生的IL-18能诱导IFN-γ的产生和上调Fas配体的表达，用IL-18单抗能减轻LPS诱导的肝细胞损伤。反应氧中间产物（ROI）也是KC的一种重要效应物质，ROI可引发脂质过氧化反应，损伤生物膜系统及核酸、蛋白质。在肝脏缺血及再灌注损伤模型中，预先用大剂量的视黄醇或加热灭活的痤疮丙酸杆菌激活KC，ROI释放量增多，反之则减少，表明KC是大量ROI的主要来源，KC在肝脏缺血再灌注损伤中的作用可能为：释放ROI介导了缺血再灌注早期损伤，释放趋化因子招引中性粒细胞在肝脏内聚集，由中性粒细胞介导晚期损伤。

    1.8  中性粒细胞生成增加  HIRI时，肝微循环血流速度减慢，肝血窦淤血及白细胞数量增加，并引起中性粒细胞聚集、黏附并活化，增强与内皮细胞黏附，内皮细胞表面黏附分子表达明显升高，从而加剧了中性粒细胞的聚集。其病理生理意义是：（1）中性粒细胞活化后损伤效应中的活性氧产物、脂质成分、蛋白酶、细胞因子等直接或间接引起肝细胞的损伤，导致肝功能衰竭；（2）中性粒细胞浸润过程中的各种因子作用下，使血管通透性增加，大量水分、蛋白渗入组织间隙，引起组织水肿、循环障碍和多器官功能障碍综合征（MODS）；（3）中性粒细胞大量聚集于肝脏和全身各脏器的毛细血管中，造成机械性阻塞，加重了微循环障碍，加重全身各组织器官的缺血、缺氧；（4）中性粒细胞与血管内皮的交互作用，激活并消耗凝血因子和血小板，加上肝功能的损坏，凝血因子产生的减少，加重了凝血障碍；（5）再激活的中性粒细胞通过NADPH氧化酶，产生呼吸爆发，释放大量的氧自由基［23］，还与血管内皮细胞黏附，促进肝微循环“无复流”现象的产生，加重肝细胞损伤。

    1.9  内毒素肝损伤  内毒素（LPS）参与了肝脏缺血再灌注损伤的过程［24］，其主要机制如下：LPS通过刺激Kupffer细胞释放TNF-α、PAF、IL-1等炎性介质，进一步作用于肝窦内皮细胞及微血管，激活内凝系统，导致肝内微循环障碍；激活的Kupffer细胞释放的炎性因子可促进中性粒细胞在肝窦中的聚集，进一步通过“呼吸爆发”等导致肝细胞损伤；复灌期间增多的LPS通过与肝细胞膜上特异性抗体结合，直接损害肝细胞［25］。但近年有多位学者报道了在再灌注前24 h预先使用小剂量LPS对动物进行预处理可获得明显的心肌保护效应［26］，其具体机制不清。

    2  药物预适应研究进展

    药物预适应是针对损伤机制利用某些活性物质直接或间接的药理作用来达到类似缺血预适应的保护作用，增强组织或细胞对缺血再灌注损伤的耐受性，从而减轻损伤，目前研究证实有保护作用的主要有:钙离子拮抗剂，自由基清除剂，炎性细胞因子抑制剂，微循环改善药物，能量底物，中药以及其他一些物质。

    2.1  钙离子拮抗剂  基于肝细胞钙超载引起损伤的理论，人们尝试用钙离子阻断剂来保护肝细胞。Hai等［27］研究表明：线粒体（ATP）钾通道开放剂尼卡地尔能明显降低大鼠HIRI后血浆转氨酶、乳酸脱氢酶水平，大大抑制再灌注后TUNEL阳性细胞数，抑制线粒体细胞色素C的释放和caspase-3的激活，防止HIRI;通透转运孔（permeability transition pore，PTP）抑制剂S15176可防止PTP的开放以保护细胞［28］。钙离子阻断剂作用原理可能是：阻滞缺血期Ca2+内流，从而抑制黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XDH）向黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的转化，减少了IR时氧自由基的产生；阻滞缺血细胞内Ca2+的有害分配，使线粒体Ca2+不释放入胞浆；解除氧自由基对NADH-辅酶Q-还原酶的抑制；减轻氧自由基对线粒体电子传递链的损害；扩张血管，改善微循环，使IR后微循环障碍得以改善，阻断由此导致的恶性循环和最终的无血灌注现象。

    2.2  自由基清除剂  氧自由基是一种含一未配对电子的化学物质，具有高度的不稳定性，在机体内可对蛋白质、脂肪及核酸等几乎所有的生物活性物质有损伤作用。肝脏缺血再灌注时，机体可产生大量的氧自由基，损伤肝组织细胞。2-mercapto-propionylglycine（MPG）为一种高效细胞渗透性氧自由基清除剂，体内外的多种研究均已证实其能有效清除氧自由基［29］。大鼠实验研究亦发现别嘌呤醇可防止线粒体氧化、脂质氧化反应，保护肝细胞能量代谢，从而防止HIRI［30，31］。

    2.3  炎性细胞因子抑制剂  抗TNF单抗或TNF抑制剂，或抗P-选择素单抗预处理，能降低肝脏IR后肝和血浆中的TNF水平，降低P-选择素的表达，因而能减轻HIRI所造成的损伤；干扰素可显著下调大鼠肝脏IR损伤后肝组织中巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）mRNA的表达；复合型选择素（TBC-1269）25 mg／kg静注到大鼠体内，可抑制HIRI损伤后肝组织中MIP-2 mRNA的表达，使失血性休克大鼠的存活率显著提高；分泌型中性粒细胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）能显著地减少小鼠肝脏IR损伤后血浆MIP-2水平，减轻肝脏的IR损伤；Kupffer细胞在激活时，可释放IL-1、IL-6、TNF-α等多种细胞因子，产生活性极强的超氧阴离子和羟自由基，对细胞产生毒性作用，用Kupffer细胞抑制剂防止和减轻肝缺血再灌注损伤；IL-13能通过降低TNF-α、MIP-2、内源性E选择素而防止HIRI；抗胆碱能药物乙酰胆碱受体拮抗剂3，4-dimethylphenyl piperazinium（DMPP）能明显减少大鼠再灌注后炎性细胞因子 TNF-α、IL-6及MIP-2，减轻组织病理学损害［32，33］。

    2.4  抗细胞凋亡  抗细胞凋亡是HIRI重要的靶标，NO、caspase抑制剂、钙蛋白酶（calpain）抑制剂、丹参等对细胞凋亡均有调节作用。Tsung等［34］认为乙酰丙酮酸能抑制大鼠实验性HIRI细胞内信号调节激酶如 p38、c-Jun、JNK丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、NF-κB，降低脂质过氧化物，下调炎性介质，抑制细胞凋亡从而发挥对HIRI的保护作用；人类重组红细胞生成素（human recombinant erythropoietin rhEPO）通过减少氧化应激和caspase-3活性，从而减少细胞凋亡而发挥对HIRI的保护作用［35］；FNK蛋白是从抗凋亡蛋白Bcl-x（L）中提取出来的，Nagai 等［36］认为PTD-FNK能强烈抑制HIRI导致的凋亡。

    2.5  内皮素受体拮抗  ET-1（内皮素-1）参与了肝脏缺血再灌注损伤，这种损伤与肝脏微循环障碍有关。实验研究表明，内皮素受体A拮抗剂可减轻大鼠原位肝移植中低温IR损伤有关的微血流动力学紊乱［37］。

    2.6  微循环改善药物  一些能够改善肝脏微循环灌注从而提高组织氧含量的措施被用于HIRI: 前列腺素I2、前列腺素E2、前列腺素E1、消炎痛等药物可提高组织细胞中的cAMP含量，扩张血管，对抗TXA2，改善肝脏微循环［38，39］；内皮素受体拮抗剂Bosentan可减轻再灌注时因内皮素水平升高而造成的微循环功能紊乱［40］。潘生丁可提高内源性腺苷的生物利用度、并减轻白细胞和内皮细胞的相互作用，从而起到改善微循环的作用［41］。另外，腺苷的前体S-腺苷蛋氨酸，可提高组织腺苷水平、舒张血管、减少血小板聚集，从而改善肝脏微循环，NO前体N-乙酰半胱氨酸和生理性氮供体L-精氨酸可提高内源性NO的产生，从而抑制血小板和白细胞黏附，多巴胺可提高缺血再灌注肝脏的血流量，罂粟碱可明显降低肝血管阻力并能提高组织ATP水平，从而改善微循环。

    2.7  中药  中药能活血化瘀如：中药丹参对肝脏IR损伤具有保护作用［42］，可能的机制是直接清除氧自由基；具有Ca2+拮抗剂样作用，阻滞Ca2+逆流；防止Ca2+在细胞内聚集造成的损害；改善缺血组织的腺苷酸代谢及肝脏微循环。

    海风藤酮于中草药海风藤中提取，为特异性PAF拮抗剂，能阻断PAF引起的生物学效应。海风藤酮可以减轻肝脏缺血时脂质过氧化程度，改善肝脏功能，增加肝脏能量储备，其机制可能是海风藤酮可以在细胞膜表面的PAF受体位点与新形成的PAF竞争，从而阻断PAF的药理作用，减轻肝脏炎症反应［43］。

    2.8  其他一些物质  其他尚有许多药物或物质可以减轻肝脏缺血再灌注损伤:如亚砷酸钠、抗ICAM抗体、有机锗Ge-132、前列腺素E1、蛋白酶抑制剂抑肽酶（AP）、锌、乌司他丁、血管紧张素Ⅱ-1型受体拮抗剂TCV-116、前列环素类似物（OP-2507）、PARS（核酶聚合酶）抑制剂尼克酰胺、己酮可可碱、异丙酚等。合成的蛋白酶抑制剂GM可以防止人肝切除时的IR损伤，并减少血浆中促炎症细胞因子IL-6的产生［44］；降钙素基因相关肽（CGRP）是首次应用基因工程方法发现的一种生物活性多肽，广泛分布于中枢和周围神经系统，具有广泛的生物学作用，可拮抗由内皮素引起的肝损伤并可减轻由IR诱发的胃黏膜及心肌损伤，且使肝脏脂质过氧化有减轻趋势。

    3  展望

    综上所述，肝脏缺血再灌注损伤是一个复杂的、各种因子交互作用的、连续的、有机的过程。研究者虽做了许多的临床和基础研究，但是，肝脏缺血再灌注损伤仍是许多临床手术和疾病过程中较为棘手的问题，其严重者仍可导致不可逆的肝功能衰竭和全身多脏器功能衰竭，进一步研究其分子机制，寻找新的药物靶标和药物作用机制是今后的发展方向。

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