白藜芦醇对秀丽线虫衰老的影响

我国已经进人了老龄化社会,老年人口正逐年增加。随着年龄增加,以致人体渐渐衰老,伴之而来的是老年性疾病如冠心病、糖尿病、神经退行性疾病、骨质疏松等明显增多,给家庭和社会带来了极大的经济和精神负担;这些老年性疾病是由多因素引起、多基因参与作用,而机体衰老是一个共同的因素。因此,寻求抗衰老的策略已成为当务之需。近年来大量研究的白藜芦醇(RES)不仅是抗氧化剂,具有预防肿瘤,还有抗衰老的功效[1]。然而,RES的延缓衰老的作用及其机制尚未完全阐明。因此,本研究以国际上公认的衰老研究领域的主要模式生物秃浙丽线虫为研究对象,以线虫的平均寿命、生殖能力和压力应激能力等为切人点,深入研究RES延缓衰老的效果及其机制,具有重要的理论研究意义和应用价值。

1材料与方法

1.1材料、试剂与药物

E。coli OP50:由Caen。rhabditis Genctics Center(University of Minnesota,St.Paul,MN,CGC)惠赠。高-低温生化培养箱(上海智城分析仪器有限公司),XXT体视显微镜(上海科学器材有限公司),二甲基亚砜()methyl sulfoxide,DMSO)(Sigma公司),5-氟脲嘧啶。白藜芦醇购自上海胡克生物科技中心,纯度≥98%。

1.2方法

1.2,1 线虫的培养 取OP50菌种于LB平板划线,挑取单菌落于在10mL LB液体培养基中,37℃,200rpm,振荡培养12h,至OD600=0,4,用于接种NGM喂养正常组线虫。

1.2.2 E.cili OP50涂布在每个NGM平板上加适量的菌液(一般直径55mm平板加100uL),用无菌的涂布器或玻璃试管底部将菌液均匀地涂布在NGM平板上,注意菌液边缘应距离平板边缘0.5 cm左右。涂布好细菌的NGM平板在室温(21~25℃)下过夜后即可使用,如果不是立即使用则应将其置于冷室或4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 线虫的喂养 参照S.henne所用方法进行线虫的培养。本实验中培养的线虫均为雌雄同体,实验室标准培养条件(温度⒛℃,湿度40%~60%)下生长。线虫的生命周期可以分为4个阶段:胚胎发育期(受精卵至L1幼虫)、生长发育期(I1幼虫至成虫早期)、生殖期(产卵阶段)及生殖后期。将培养中的L3至L4期野生型线虫(P0代)转移至新的NGM平板,线虫在水的张力下被限制在琼脂培养基的表面做正弦运动。在产卵期(第3.5天),P0代的线虫每隔1d转移至新板,以便与子代(F1代)区分开,在相同条件下继续培养观察,直到死亡。

1.2.4线虫产卵数量的观察取10条处于L4期的线虫到平板中,每个平板放置1条线虫。每隔24 h将线虫转移至新的平板中,转移4~5次后,线虫基本不再产卵。将平板继续在培养箱中培养,待子代线虫孵化长大后,在其进入产卵期之前对线虫数目进行计数,每条母线虫在6~7个平板中产卵数的总和就是该线虫的产卵数量。

1.2.5线虫的同期化首先挑取处于产卵期的线虫若干条在一个平板中,具体数量视所需要的线虫数量而定,一般1条产卵期线虫1h可以产卵4~8个。30min后,将线虫挑出,平板中的卵则处于同一发育时期。

1.2.6线虫的保存方法培养3~5板线虫,保证平皿中60%以上的线虫进人dauer期,并且无污染,无大肠杆菌。dauer期线虫抵抗外界压力能力强,复苏后成活率高。在线虫平板上每板加3mL M9缓冲液,在琼脂表面上轻轻摇动。将悬液都吸入。每个冻存管加0,6mL带有线虫的M9缓冲液。加人等体积的冻存缓冲液,混匀。将冻存管放人泡沫盒中,放入-80℃冰箱中保存,1h后取出同批冻存中的1~2个样本复苏,以检验复苏成功率。复苏时,用手将冻存管中溶液捂化,直接倒人NGM板中即可。如果需要保存更长时间,转至液氮中。

1,2.7线虫除菌方法线虫培养过程中,如操作不当,容易被除OP50以外的细菌、真菌污染。真菌污染时,只需在板中相对干净的区域挑取2~3条线虫转移至新板即可。细菌污染时,需重新复苏。

1.2.8药物质量浓度一效果检测实验结合文献报道和预实验结果将RES干预质量浓度定为⒛、40、60、80m酽L。动物分组:EF O mg/L(正常对照组)、⒛、40、60、80mg/I'组,进行寿命实验以选出RES作用的最佳剂量。

1,2.9线虫寿命实验分组:正常对照组、RES60 mg/I'组(RES组)。实验步骤:参见B.Lakowski等[3]的方法,将雌雄同体成虫置于含或不含RES的NGM板中产卵0.5~1h。受精卵⒛℃下孵育47 h发育为L4期后,转人相应浓度实验板中,每组实验样本数不少于30条,此时记为寿命实验day0。隔天探视线虫,记录线虫生存、死亡及剔除出实验的条数。对线虫死亡判断标准:无移动及吞咽动作,轻触后仍无任何反应。剔除标准:(1)逃离至平皿壁或盖上而干死;(2)虫卵在体内孵化而成袋样虫;(3)钻人琼脂中。

1.2.10线虫生殖能力测试分组:正常对照组、RES60mg/L组。实验步骤:参照J,Grubcr等E遮]的方法,挑取L钅期线虫至各组,L4期线虫准备同寿命试验,单独每条转人NGM板,此时记为生殖实验day1。以后每24h移至新的NGM板中直至线虫生殖能力丧失。所有产卵板均在⒛℃下孵育24h后计数子代数目。

1.2.11急性热应激实验分组:正常对照组、RES 60mg/L组。实验步骤:参见Mark等E5彐的方法,将雌雄同体成虫置于含或不含EF的NGM板中产卵0,5h,受精卵⒛℃下孵育59h发育为成虫后,实验置于35℃进行,每隔1h计数线虫死亡、存活数目。线虫死亡标准同寿命实验。

1.2.12急性氧化应激实验分组:正常对照组、RES60mg/L组。实验步骤:参见S.A。Duhon等E6]的方法,将雌雄同体成虫置于含或不含EF的NGM板中产卵0,5h,受精卵20℃下孵育59h发育为成虫后,实验在含40mM H2O2的96孔板中进行,每孔挑入5条线虫,每0,5h计数线虫死亡、存活数目。线虫死亡标准同寿命实验。

1.3统计学方法

计量资料数据以均数土标准差(Ξ±s)表示,采用SPSS13,0统计分析软件进行数据的统计学处理,组间计量资料比较采用莎检验,P(0,05为差异有统计学意义。

2结果

2.1药物质量浓度一效果检测结果如表1所示,与正常对照组相比,RES20、40、60、80mg/L均能延长线虫的平均寿命,以RES 60mg/L组最为显著,效果优于其他剂量组。

2.2线虫寿命实验结果与正常对照组比较,RES组能延长线虫的平均寿命E(20.11±2.82)d vs,(30,98±4.34)d](P<0.01)。

2.3生殖能力测试结果线虫在性成熟后第2天和第3天进人生殖高峰期,本实验中测得生殖高峰期子代数目正常对照组为1⒛±23,24(r=15),RES组为149±22.67(r=15),两组相比差异有显著的统计学意义(P(0.01)。

2.4急性热应激实验结果与对照组比较,RES能显著增强线虫的耐热能力,RES线虫在35℃时的平均生存时间延长E(6.71±1.3)h vs,(8.93±1.6)h](P(0,01)。

2.5急性氧化应激实验结果与对照组比较,RES组线虫的抗氧化能力显著增强,线虫在40mM H2O2中的平均生存时间延长E(5,89±0.82)h vs,(7,99±1,08)h](P(0,01)。

3论讨

本实验发现RES在一定质量浓度范围内延缓秀丽线虫衰老。本实验使用不同剂量的RES(~90、40、60、80mg/L)干预秀丽线虫的衰老,结果表明,60mg/L的RES效果优于其它剂量;在RES 60mg/L的干预下,秀丽线虫的平均寿命延长,具有明显的促生殖峰期作用,能延长线虫在急性热应激和急性氧化应激环境下的平均生存时间,提高线虫压力应激能力等。RES的化学名为3,5,仁三羟基二苯乙烯,是一种多酚类天然产物,在葡萄、花生、虎杖等植物中含量较高。RES是天然的植物抗生素,帮助植物抵抗真菌和细菌的感染侵袭。RES具有多种药理作用,如延缓衰老、抗氧化、预防肿瘤发生等。

RES对多种老年性疾病有干预作用,其作用的分子机制与激活SIRT1去乙酰化酶、抗氧化以及引起其他相关分子的表达有关[1]。秀丽线虫作为衰老研究的模式生物具有非常大的优势。1982年,Thomas E,Johnson和William B。Wood在P,N。A,S上发表了《Gcneuc analy⒍s of life-span in C.elegalls》,发现daf2突变能够将线虫寿命延长至正常寿命的2倍,此发现可视为线虫进人衰老研究领域的标志性事件。在以后的25年时间里,有关线虫衰老的研究迅速超过果蝇和小鼠,成长为衰老研究的首选模式生物。线虫衰老研究揭示了衰老遗传调控程序中的多个重要发现,其中最为瞩目的为胰岛素/胰岛素样生长因子△信号传导途径。ⅡS通路是研究得最为广泛和透彻的一条衰老进程调控通路,目前证明其能影响包括线虫,果蝇和哺乳动物在内的一系列生物的寿命。为评价RES延缓衰老的效果并探索其作用机制,本研究引进模式生物秀丽线虫作为研究对象。

秀丽线虫生命周期短,可重复大样本寿命实验,并且与其寿命相关的遗传和环境背景较清晰,非常适合进行衰老干预效果的评价和机制研究。在秀丽线虫上进行的寿命分析实验、生殖能力测试和压力应激测试所得之指标可构成简单的药物干预衰老评价系统,并可对药物作用机制进行初步探索。本实验所用指标在评价衰老干预效果中具有重要意义。本实验对秀丽线虫进行了寿命实验,生殖能力测试和压力应激实验。寿命实验是抗衰老研究线虫实验中运用得最普遍的实验叫。在寿命实验中仅需确认存活和死亡两种状态,非常适用于在形体仅1mm左右的线虫上操作。同时,由于衰老个体差异性大,寿命实验宜以较大样本量进行,以消除衰老的个体差异给实验结果造成的误差,而在线虫实验中很容易得到大样本量的同期化线虫。生殖能力测试评价药物在延寿作用的对生殖能力有无损害,检测药物作用是否通过生殖与长寿之间的“利弊权衡(trade off)机制起作用。同时,从开发衰老干预措施的角度而言,抗衰老药物本身应该满足在延缓衰老的同时不损害机体生殖能力的条件。长寿与生殖的关系备受争议。通过对自然界生物行为、某些长寿突变体以及热量限制(CR)的观察,人们发现寿命的延长与生殖能力成反比关系。因此一部分老年学家认为长寿与生殖之间存在“利弊权衡”。

对于这种“利弊权衡”机制的解释之一就是“有限资源的矛盾需求(confhc0ng requiremcnts for resources)”学说。该学说认为:生殖、体细胞的维持和修复、发育、运动等均是机体内耗能多的进程,而体内可利用的资源是有限的,不可能充分供应到各个进程。因此,“利弊权衡”机制必须启动。分配于生殖的资源不能再用于机体的修复和生存的维持,从而使寿命缩短。反之,寿命的延长必然会以降低或丧失生殖能力为代价的,可利用的有限资源被机体在“利弊权衡”的机制下,将原本用于生殖的那一部分调用到维持生存。生殖与寿命存在固有的逆向关系。但随着研究的深人,人们发现不尽如此,在自然界中、某些长寿突变体以及某些延长寿命的天然物中均存在反例[13],机体的这种“利弊权衡”并不总是起作用的。如下调ⅡS信号传导通路所致的线虫突变体中,某些长寿突变体具有正常的生殖能力。在成年期后下调ⅡS通路也可延长线虫寿命而不影响生殖。果蝇Indy突变体和STACs突变体不仅寿命延长而且产出的后代增多。最近几年抗衰老领域研究较多的化合物白藜芦醇在延长线虫寿命的同时对线虫的生殖能力也无损害[4]。所以本实验进行了生殖能力测试。压力应激状态下生存率的提高与寿命的延长则具有很强的正相关性,压力应激能力提高是线虫寿命延长的解释之一.研究发现,几乎所有已知线虫的长寿突变体都显示了在环境压力下抵抗能力提高的特性。这些长寿线虫在氧化压力、热休克压力、紫外线放射压力和重金属毒性压力下的平均生存时间都较野生型提高。同样,在果蝇、小鼠和多种哺乳动物的成纤维细胞中也显示,在寿命延长同时压力应激能力提高。压力应激实验已经成为抗衰老实验中的常规项目。

寿命的延长与在压力应激状态下生存率提高具很强的正相关性,RES不仅能提高线虫的急性热应激能力,还能提高线虫的急性氧化应激能力,这可能是RES干预衰老的机制之一。胰岛素/胰岛素样生长因子I信号传导途径(Insulin/IGF1Signahng Pathway,ⅡS)被认为是寿命调节的中心环节,核受体通路和沉默信息调解子2.1(Sllent Informaoon Rcgulator2,1,SIR2,1)可能通过调节ⅡS通路的下游分子DAF16/FOXO活性发挥延长寿命作用,从而与ⅡS通路重叠,也有可能通过其他途径,与ⅡS平行发挥作用,这些信号通路参与了秀丽线虫衰老的遗传调控机制[10]。至于RES是否通过上述信号通路发挥延缓衰老的作用,还有待深入的实验研究来阐明。

参考文献

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