rh-bFGF对兔视网膜缺血再灌注损伤的保护作用
发表时间：2014-01-17 浏览次数：863次
视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)是眼科临床上常见的病理生理损伤过程。视网膜血管阻塞、急性闭角型青光眼急性大发作以及影响视网膜血流的手术等均可造成不同程度的视网膜缺血再灌注损伤，并最终导致视功能的损害。RIRI过程中，损伤主要导致视网膜神经节细胞及内核层细胞的凋亡，细胞凋亡过程受多种基因的调控，其中c-fos和c-jun被认为与细胞凋亡存在密切关系。 rh-bFGF是一种多功能活性物质，具有诱导新生血管生成、参与创伤修复、保护中枢及外周神经元免受损伤并刺激其再生等作用。本实验通过前房加压灌注法建立兔RIRI模型后，给予玻璃体腔注射rh-bFGF，观察视网膜缺血再灌注损伤后c-fos和c-jun基因表达的变化，进一步研究RIRI时rh-bFGF对视网膜损伤保护作用的可能机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选择28只健康纯种大耳白兔，雌雄不限，体重 2.0～2.4 kg。随机分为正常组、缺血再灌注模型组、rh-bFGF治疗组，正常组(4只)、缺血再灌注模型组(24只)、rh-bFGF治疗组(24只)，其中缺血再灌注模型组为24只兔左眼，RIRI后玻璃体腔注入平衡盐溶液，rh-bFGF治疗组24只兔右眼，RIRI后玻璃体腔注射rh-bFGF治疗。缺血再灌注模型组和rh-bFGF治疗组按照不同时间段分为再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h (4只/组)6个时间，此两组除对比因素外，其他条件相同。主要试剂：rh-bFGF试剂(上海西塘生物科技有限公司)，c-fos单克隆抗体、c-jun单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。1.2 方法：视网膜缺血再灌注模型的制备采取前房加压灌注法[1]。 rh-bFGF治疗组在缺血再灌注刚开始时以微量注射器抽取配制好的rh-bFGF10μl(相当于rh-bFGF 2μg)，注入玻璃体，同时向兔左眼注入平衡盐溶液10 μl作为对照。分别于损伤后1 h、6 h、 12 h、24 h、48 h和72 h时间点随机取各组造模动物4只，处死动物并摘除眼球，制作石蜡切片。将切片常规脱蜡后热修复抗原，滴加H2O2灭活内源性酶，滴加山羊血清封闭液封闭。依次加入一抗、生物素化二抗，SABC，DAB显色液，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察，每只眼球随机取两张切片，每张切片随机取4个视野，用图象分析系统进行分析，测定视网膜神经节细胞层c-fos和c-jun的平均吸光度值(IOD值)，数据进行统计学处理。 1.3 统计学分析：使用SPSS 18.0对各项资料进行统计、分析，各项参数以均数±标准差( x ± s )表示，采用t和χ2检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
正常组兔视网膜组织中无c-fos、c-jun蛋白的阳性表达，缺血再灌注模型组中缺血再灌注1 h时兔视网膜组织神经节细胞层可见两者阳性表达，缺血再灌注6 h时表达较前增加，随时间延长 c-fos、c-jun蛋白表达逐渐增强，表达在24 h达到高峰，之后表达开始下降，缺血再灌注72 h时两者表达明显降低。rh-bFGF治疗组各时间点c-fos、c-jun蛋白的阳性表达较缺血再灌注模型组明显减少，缺血再灌注模型组和rh-bFGF治疗组表达结果进行比较，在再灌注6～48 h差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1～2。
3 讨论
大量研究证明，凋亡是视网膜缺血再灌注损伤中神经细胞丢失的主要形式之一，c-fos和c-jun被认为与细胞凋亡存在密切关系[2-3]。本实验中正常兔视网膜组织各层未见两者明显的表达，缺血再灌注1 h时可检测到两者表达，之后c-fos蛋白和c-jun蛋白的表达随着时间的延长而逐渐增强，24 h达到高峰，48 h开始下降，72 h后表达已经明显减弱。说明视网膜缺血再灌注损伤中存在c-fos、 c-jun的表达，并可诱导执行凋亡相关酶和蛋白的表达，最终导致视网膜神经节细胞受损并最终导致死亡。 rh-bFGF可诱导内皮细胞的迁移，促进毛细血管的增生，形成胶原纤维，并使毛细血管内皮细胞、血管平滑肌细胞迅速增殖，改善局部微循环和组织的营养状况。本实验应用rh-bFGF玻璃体腔注射后，视网膜组织内c-fos、c-jun蛋白的阳性表达较缺血再灌注组显著减少。此实验结果表明，视网膜缺血再灌注损伤后行rh-bFGF玻璃体腔内注射，可通过减弱c-fos、c-jun蛋白的表达，对视网膜缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。总之，在视网膜缺血再灌注过程中，rh-bFGF可使视网膜中凋亡相关基因c-fos、c-jun蛋白表达减弱可能是其重要机制之一。rh-bFGF应用于临床，将在视网膜缺血再灌注损伤性疾病的临床治疗方面提供更广阔的思路。
4 参考文献
[1] Foulds WS,Johnson NF.Rabbit electroretinogram during recovery from induced ischaemia[J].Trans Ophthalmol Soc U K,1974,94(2):383.
[2] Miyaki K,Matsubara A,Nishiwaki A,et al.Pitavastatin attenuates leukocyte-endothelial interactions induced by ischemia-reperfusion injury in the rat retina[J].Curr Eye Res,2009,34(1):10.
[3] Manome Y,Datta R,Taneja N,et al.Coinduction of c-jun gene expression and internucleosomal DNA fragmentation by ionizing radiation[J].Bio-chemistry,1993,32(40):10607.
[收稿日期：2013-03-11 编校：苏建东]
